基質輔助激光解析質譜成像可視化分析三七皂苷空間分布

劉芳 趙瀚森 孫公偉 宋哲 徐富建 馬明英 張四純

摘要根據2，5二羥基苯甲酸（DHB）、 α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、石墨烯（GR）、氧化石墨烯（GO）和碳納米管（CNT）5種基質混合人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以及三七皂苷R1 3種標準品得到的質譜信號，選取DHB為基質。將20 μm厚度的三七根莖冷凍切片真空干燥40 min后，在循環60次、噴霧強度30%、噴霧時間1 s、孵育時間40 s、干燥時間60 s的條件下，將DHB均勻覆蓋于切面。質譜數據采集質量范圍為m/z 0～1500 Da，使用PEG600進行質荷比校準，以1000 Hz頻率的正離子反射模式進行基質輔助激光解吸質譜成像（MALDIMSI），觀察到10種皂苷在三七根莖木栓層、韌皮部、木質部以及髓部的3種空間分布情況，同時對質譜數據進行t分布領域嵌入算法分析（tSNE），實現了2年生和3年生三七根莖的區分。本研究為三七根莖組織中代謝物的表征提供了原位、可視化的方法，也為三七根莖的特異性提取提供了有價值的信息。

關鍵詞基質輔助激光解吸電離; 質譜成像; 三七根莖; 皂苷

1引 言

三七（Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen）是五加科人參屬中的一種藥食同源植物[1，2]，具有活血化瘀、止血、消腫止痛的功效。研究發現，三七還具有抗腫瘤、提高機體免疫力和防治心腦血管疾病等藥理作用[3]。三七的主要活性成分是一系列三萜類皂苷。目前，從三七中已分離得到七十多種皂苷，均為達瑪烷型四環三萜類化合物，按結構可分為原人參二醇型（Protopanaxadiol，PPD）和原人參三醇型（Protopanaxatriol， PPT）[4]。

目前，市場上常見的三七為2年生和3年生兩種。因產地、年限及部位的不同，皂苷種類及含量也呈現出差異性。不同產地總皂苷和單體皂苷的含量存在顯著差異[5～7]，三七皂苷含量與生長年限之間有明顯的相關性[8，9]。沙孟晨等[10]對三七植株不同部位的5種皂苷進行了測定，發現不同部位的化學成分存在差異，根莖中5種皂苷的含量最高。

對三七的研究常采用色譜質譜聯用的方法[11，12]，但該方法無法給出各種成分在三七植株分布的信息。基質輔助激光解吸質譜成像（Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging， MALDIMSI）是一種分子可視化技術，測定時，分析物從樣品表面原位離子化，借助質譜的化學特異性，在一個實驗中可同時獲取多種分析物的離子圖像，直接呈現其分子結構和空間分布信息，非常適用于復雜體系的樣品分布分析[13，14]。MALDIMSI提供的大量信息，也為研究者從多角度解決復雜的生物系統問題提供了可能性。研究人員利用MALDIMSI對芍藥根[15]、甘草[16]、銀杏葉[[17，18]、人參[19]等藥用植物中代謝產物的分布進行了研究，并結合分布情況，對植物防御和生物合成途徑進行了探討。本研究在比較不同基質的基礎上，選擇DHB作為基質，采用手指回溫的方式對整株三七中皂苷含量最高的新鮮根莖進行冷凍切片，利用MALDIMSI技術獲得了皂苷的空間分布信息，為特異性提取及代謝物研究提供了有價值的信息。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UltrafleXtreme基質輔助激光解吸飛行時間質譜（德國Bruker Daltonics公司），配備Nd：YAG激光器（波長為355 nm），FlexAnalysis 3.4和FlexImaging 3.0軟件;自動基質噴霧儀ImagePrep（德國Bruker Daltonics公司）;CM1950冷凍切片機（德國Leica Microsystems公司）;AL204電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）;DS2510DTH超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）;MXS旋渦混勻儀（美國Scilogex公司）;超純水系統（Millipore公司）。

2，5二羥基苯甲酸（DHB）、α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、三氟乙酸（TFA）、多聚L賴氨酸（Sigma公司）;乙醇（天津市永大化學試劑有限公司）;乙腈（賽默飛世爾科技中國有限公司）;冷凍包埋劑OCT （Sakura公司）;人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1（上海源葉生物科技有限公司）;石墨烯（GR）、氧化石墨烯（GO）和碳納米管（CNT）購于蘇州碳豐石墨烯科技有限公司。三七采挖于云南省文山州硯山縣三七種植基地。

2.2標準溶液和基質的配制

用乙腈水（1∶1，V/V）及0.1% TFA混合溶液將人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1標準品均配制成2 mg/mL的溶液，DHB和CHCA配制成30 mg/mL的溶液，4℃保存。GR、GO及CNT均各取2 mg懸浮于1 mL乙醇中，超聲處理3 min后使用[20]。

2.3樣品的制備

將清洗干凈后的新鮮三七根狀組織于-80℃儲存，備用。冷凍切片時，使用OCT作為粘合劑，將三七固定于冷凍切片機的樣品架上，在20℃下，采用手指回溫的方式獲取組織切片。組織切片厚度<20 μm時，三七組織結構容易斷裂或出現空洞;厚度≥20 μm的切片組織結構完整，厚薄均勻。考慮到組織切片越薄，圖譜質量越好，故選取樣品的切片厚度為20 μm。切片熱融緊貼于用0.1%（w/V）多聚L賴氨酸水溶液處理過的導電玻璃上[21]，隨后將樣品切片真空干燥40 min。用ImagePrep將基質均勻的覆蓋于樣品切片上。ImagePrep的儀器參數為：循環60次，噴霧強度30%，噴霧時間1 s，孵育時間40 s，干燥時間60 s。

2.4質譜成像（MALDIMSI）和數據處理

質譜成像采用UltrafleXtreme基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀，以1000 Hz頻率的正離子反射模式獲得數據。儀器掃描步長為200 μm，激光能量強度為40%，激光設定數據采集的質量范圍為m/z 0～1500， 使用PEG600進行質荷比校準。

獲得的質譜數據使用FlexAnalysis 3.4進行平滑和基線校正處理;成像結果利用FlexImaging 3.0軟件對獲得的質譜進行總離子流歸一化（TIC）處理，隨后利用t分布領域嵌入算法（tSNE）對質譜數據進行分析。

3結果與討論

3.1基質種類的選擇

比較DHB、CHCA、GR、GO以及CNT分別作為基質時人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1 3種皂苷標準品的質譜信號。由圖1可見， 5種基質中除DHB基質峰都在800 Da以下，其余4種基質在800 Da以上仍出現基質峰。由圖2可見， DHB作為基質可以檢測到m/z 823.860、955.929、1131.995處3種皂苷的[M+Na]+峰，另外4種基質只能檢測到兩種皂苷的峰或3種均不出峰。考慮到排除基質干擾的同時，獲得最佳的檢測靈敏度，選擇DHB作為基質。

3.2三七皂苷MALDIMSI的識別和成像分析

按照上述選定的實驗條件，對三七根莖部分組織切片進行了MALDI成像分析。根據測到的質譜峰，參照文獻[22～34]已報導的三七根莖中皂苷的成分，并與人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1標準品質荷比進行對照，對信號峰進行了歸屬（表1）。

三七根莖的MALDI譜圖中，所有的皂苷都是以鉀加合離子的形式出現。K+在植物體內參與了糖類的運輸，而糖類也是皂苷主要結構的一部分，這也與三七是典型的喜鉀植物相吻合。

由圖3可見，根莖中鑒定出的三七皂苷均呈現出在木栓部分布較集中的特點。這與三萜皂苷類化合物具有防御環境脅迫和病蟲害等危害的功能相關。

3.3三七根莖皂苷的生物代謝合成途徑與分布

在三七根莖的MALDI成像圖中， 人參皂苷Rb1在木質部和髓部均有分布，人參皂苷Rg1和三七皂苷R1幾乎只存在于木栓層。人參皂苷Rg1和三七皂苷R1屬于原人參三醇型皂苷，人參皂苷Rb1則屬于原人參二醇型皂苷。這兩類皂苷在植物體中都是先經過甲羥戊酸（Mevalonate， MVA）或糖酵解（EmbdenMeyerhofParnas， MEP）途徑合成異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate， IPP）或二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate， DMAPP）; IPP或DMPP又通過異戊烯基轉移酶和萜類環化酶的催化合成2，3氧化鯊烯（2，3Oxidosqualene）; 2，3氧化鯊烯依次經過環化、羥基化、糖基化修飾，最終形成達瑪烷型三七皂苷[35]。在此合成過程中，2，3氧化鯊烯是三七皂苷生物合成的共同前體，它的環化過程是各種三萜生物合成多樣化的第一步。原人參二醇型是2，3氧化鯊烯在達瑪烯二醇合成酶（DammarenediolHsynthase， DS）催化作用下先生成達瑪烯二醇（Dammarenedio1Ⅱ），然后細胞色素P450單加氧酶基因CYP716U1參與達瑪烯二醇C12位的羥基化所產生的。若細胞色素P450單加氧酶基因CYP716S1v2在原人參二醇C6位繼續羥基化，即可產生原人參三醇型。在糖基轉移酶（Glycosyltransferase/UDPglycosyltransferase， GT/UGT）作用下，一個或幾個單糖添加到原人參三醇上，形成了人參皂苷Rg1和三七皂苷R1;添加到原人參二醇上，形成了人參皂苷Rb1[36，37]。

人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的合成途徑相同，分布也相同;人參皂苷Rb1的合成途徑與人參皂苷Rg1和三七皂苷R1不同，分布也呈現差異性，這表明皂苷的分布與其生物代謝途徑合成途徑有關聯。因此，有望通過MALDI成像探討皂苷類化合物的生物代謝合成途徑。

3.4不同年份根莖的區分

質譜成像具有高通量的特點，提供了不同樣品的大量質譜信息。成像分析表明，三七根莖中的皂苷主要分布在木栓層，選取市售常見2年生和3年生三七根莖木栓層皂苷的質譜數據進行t分布領域嵌入算法分析（tSNE）。如圖4所示，tSNE通過對樣本數據降維后，可以明確顯示出兩種年份三七根莖質譜數據的聚類狀況，實現了2年生與3年生根莖的區分。

4結 論

通過基質的優化實現了對三七根莖冷凍切片的MALDIMSI分析，檢測到10種皂苷，并得到其分布信息。基于MALDIMSI直接分析的優勢，檢測到了極不穩定的酰基化皂苷（丙二酰基人參皂苷Rd和丙二酰基人參皂苷Rb1），獲取了多種皂苷可視化空間分布信息，有助于探討生物代謝合成途徑。在此基礎上，基于MALDIMSI數據，通過tSNE將2年生與3年生的三七根莖進行區分。本方法為三七組分的特異性提取提供了有價值的信息，也為了解三七代謝物的合成途徑提供了重要線索。

致 謝本研究得到中國科學院化學研究所聶宗秀和劉會會的幫助，謹此致謝。

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