超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)刺梨槲皮素及其糖苷類化合物的鑒定分析

王翼 顧苑婷 丁筑紅 陳思奇 肖仕蕓 余奕宏 杜勃峰 宋煜婷

摘要為探明刺梨中的槲皮素組分及其結(jié)合態(tài)糖苷類化合物構(gòu)成，采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法，通過標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照、相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜碎片等信息對(duì)刺梨槲皮素及其糖苷類化合物進(jìn)行了解析。從刺梨中共鑒定出1種槲皮素與9種含有槲皮素母核結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可確定化學(xué)組成的化合物為槲皮素、槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羥基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]、槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷，其中，槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羥基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]首次在刺梨中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)離子碎片推斷槲皮素糖苷裂解途徑，豐富了刺梨資源的基礎(chǔ)研究成果，為槲皮素結(jié)構(gòu)鑒定以及后續(xù)開發(fā)刺梨槲皮素糖苷的藥食利用價(jià)值提供了參考。

關(guān)鍵詞刺梨; 槲皮素; 槲皮素糖苷; 超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜

1引 言

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）系薔薇科薔薇屬落葉灌木，原產(chǎn)我國西南部[1]，刺梨中的功能活性成分包括維生素C、超氧化物歧化酶、刺梨黃酮、刺梨多糖，以及多種人體必需氨基酸，黃酮為其主要活性成分。槲皮素及糖苷化合物屬于黃酮醇（Flavonol），是典型的黃酮類化合物。槲皮素結(jié)構(gòu)帶有多個(gè)羥基，易結(jié)合糖基形成糖苷，糖基連接的類型與位置不同，所形成的槲皮素糖苷也不同。槲皮素及其糖苷具有抗腫瘤、抗病毒、治療糖尿病和保護(hù)心血管的作用[2]，具有良好的藥用價(jià)值。

槲皮素苷元及其糖苷分析鑒定的常用方法有薄層掃描法、熒光光度法、示波極譜滴定法、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）、高效液相色譜法（HPLC）及液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）等。其中，HPLC檢測(cè)快速準(zhǔn)確、操作簡便、重現(xiàn)性好[3]; 質(zhì)譜技術(shù)具有快速、精確、靈敏[4]等優(yōu)點(diǎn)，可以提供被測(cè)物的分子量、分子式與豐富的結(jié)構(gòu)信息[5]，在糖苷類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定中發(fā)揮了重要作用[6]; 超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法具有高分辨率、精確分子質(zhì)量、多種掃描和碎裂組合的特點(diǎn)[7]，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)母核、子離子的高分辨采集及質(zhì)譜碎裂信息獲取，除了可鑒定已知化合物，還可以通過不同化合物的裂解規(guī)律及特征碎片離子信息推斷未知化合物[8]。丁麗娜等[9]采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)沙棘果中的黃酮類化合物進(jìn)行鑒定，在沙棘果的超臨界CO2萃取物中鑒定出18種黃酮類化合物。 張伽妹等[10]利用超高效液相色譜線性離子阱靜電軌道場(chǎng)高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)柘木提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和碎片離子的精確質(zhì)量信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定出28種黃酮類化合物，并分析了槲皮素、染料木素、環(huán)桂木黃素、槲皮素7葡萄糖苷等物質(zhì)的裂解規(guī)律。刺梨果實(shí)中已經(jīng)被報(bào)道的黃酮苷及苷元有槲皮素、山奈酚[11]、楊梅素[7]、槲皮3O葡萄糖鼠李糖苷、兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、沒食子兒茶素（4α>8）兒茶素、山奈酚3OβD（6''（E）p酰基）吡喃葡萄糖苷[12]。目前，對(duì)刺梨槲皮素及糖苷的報(bào)道僅限于槲皮3O葡萄糖鼠李糖苷及槲皮素的提取方法與含量測(cè)定研究[13]，未見對(duì)刺梨槲皮素糖苷的鑒定及裂解途徑分析的報(bào)道。

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（UPLCHRMS）解析刺梨槲皮素及其糖苷類化合物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照、相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜碎片等信息對(duì)其進(jìn)行定性研究，探究刺梨黃酮中可能存在的槲皮素糖苷組分及分布。黃酮是刺梨中重要功能成分，其中，游離態(tài)槲皮素和鍵合態(tài)槲皮素是主要成分。分析刺梨中槲皮素及其糖苷類物質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可為刺梨槲皮素糖苷結(jié)構(gòu)鑒定提供參考，對(duì)提高刺梨利用率以及藥用功效具有重要意義。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜儀Q Exactive Series高分辨質(zhì)譜儀（UPLCHRMS，賽默飛世爾科技有限公司）; MilliQ Integral 5型超純水儀（美國Merck Millipore公司）; KQ2200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）; BP211D型電子天平（德國Satorius集團(tuán)）; DBS100部份收集器（上海琪特分析儀器有限公司）; RE5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

無水乙醇、石油醚（分析純，濟(jì)南明星化工有限公司）; HCl、NaOH（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 甲醇（色譜純，美國Tedia公司）。標(biāo)準(zhǔn)品：槲皮素（98.0%）、槲皮素3O鼠李糖苷（98.0%）、槲皮素3O葡萄糖苷（98.0%）（上海源葉生物科技有限公司）; 槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷（98.0%，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司）。HPD600大孔樹脂（南開大學(xué)化工廠）。刺梨（貴龍5號(hào)品種）采摘于貴州省龍里縣，新鮮潔凈，大小均勻，無霉?fàn)€，清洗瀝干后，去蒂、

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1于

20℃刺梨鮮果肉，真空冷凍干燥后粉碎，過60目分樣篩，稱取適量刺梨粉于錐形瓶中，按料液比 1∶20 （w/V）加入70%乙醇，在功率為300 W、溫度50℃條件下超聲40 min， 按料液比 1∶3 （w/V）加入石油醚浸漬30 min，去除脂溶性色素，4000 r/min 離心5～10 min，收集上清液，加入到預(yù)處理好的HPD600樹脂層析柱，進(jìn)行純化富集，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上樣液至pH 5.5，以1 mL/min速率上樣，吸附3.5 h后，用pH 4.5的70% 乙醇溶液以1 mL/min速率進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，得純化樣品液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔膜過濾，供UPLCHRMS分析用。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別稱取4.5 mg槲皮素、 5.0 mg槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷、5.0 mg槲皮素3O鼠李糖苷和5.0 mg 槲皮素3O葡萄糖苷固體標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至25 mL，得到濃度分別為0.18、0.20、0.20和0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mL，定容至20 mL，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，備用。

2.2.3UPLCHRMS測(cè)定條件色譜條件： Hypersil GOLD aQ色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.9 μm）; 柱溫為35℃; 自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為15℃; 流速為0.2 mL/min; 進(jìn)樣體積為2 μL; 流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水。梯度洗脫： 0～2 min，80% B; 2～20 min，80%～10% B; 20～22 min，10% B; 22～23 min，90% B。

質(zhì)譜條件： 加熱的電噴霧離子源（HESI），負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè); 噴霧電壓3.2 kV; 毛細(xì)管溫度320℃; 加熱器溫度350℃; 鞘氣 （N2） 流速35 arb; 輔助氣 （N2） 流速10 arb; 掃描模式為一級(jí)質(zhì)譜全掃描結(jié)合自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描模式（Full scan/ddMS2）; 掃描范圍m/z 100～1500; 一級(jí)質(zhì)譜分辨率70000，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為 17500; 歸一化碰撞能量（NCE）為20、40和60 eV。

3結(jié)果與討論

刺梨中黃酮類化合物含較多羥基，可形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，在質(zhì)譜負(fù)離子檢測(cè)模式下有較好的信號(hào)響應(yīng)[14]。采用負(fù)離子檢測(cè)模式，使總離子流色譜圖有較低的背景值，可形成的母離子通常為[M-H]

4結(jié) 論

利用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法對(duì)刺梨中槲皮素及其糖苷類化合物樣品解析，共鑒定出1種槲皮素與9種含有槲皮素母核結(jié)構(gòu)物質(zhì)，其中可確定化學(xué)組成的物質(zhì)有槲皮素、槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羥基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]和槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷，根據(jù)離子碎片推斷槲皮素糖苷裂解途徑。本研究全面分析了刺梨黃酮種類，補(bǔ)充了刺梨原料基礎(chǔ)信息，為刺梨功能的挖掘及其黃酮類化合物功效的深入研究和開發(fā)利用提供了理論參考。

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