TGF-β/Smad7信號通路在狼瘡腎炎患者腎損害中的作用研究＊

王麗萍，王春燕，晏 紅，賈旭強，張 欽

（1.蘭州大學第二醫院風濕免疫科，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學第二醫院病理科，甘肅 蘭州 730030 3.定西市人民醫院風濕內分泌科，甘肅 定西 743000；4.山西省運城市中心醫院脊柱外科，山西 運城 044000）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種主要累及育齡女性，以多系統、多臟器損害為特征的全身性自身免疫病。流行病學研究表明，我國的 SLE 患病率為 0.03%～0.7%，據此估算，我國的SLE患者有近100萬。由于自身抗體沉積靶器官及繼發性血管炎導致器官功能障礙，SLE可以造成患者殘疾甚至死亡，其中，由SLE疾病活動造成的腎臟損傷是SLE的重要臟器受損之一，影響預后，是風濕病領域的研究熱點。對其發病機制的大量研究發現SLE患者存在多種免疫細胞 (B細胞、T細胞和單核細胞系等)的功能紊亂，導致多克隆B細胞活化、高球蛋白血癥、自身抗體產生及免疫復合物的形成，究其根本原因為機體免疫耐受的喪失和免疫細胞的異常激活并對自身組織結構發生自身免疫反應。在免疫功能紊亂調節過程中諸多細胞因子及信號通路參與其中[1]。

近幾年研究發現TGF-β/Smad信號通路具有重要的生理學活性,可能是腎臟纖維化進程中的調控因子，與原發性腎臟疾病的腎小球硬化進展中細胞外基質過度沉積有關，而狼瘡腎炎患者發病中此信號通路所扮演的角色還鮮有研究。本課題將以狼瘡腎炎 （Lupus nephritis,LN）為研究對象以期發現TGF-β/Smad信號通路在狼瘡腎炎發病中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究為前瞻性研究。篩選來自2016年8月～2018年8月定西市人民醫院風濕內分泌科、腎內科和蘭州大學第二醫院風濕免疫科、腎內科住院的年齡18～50歲的60例狼瘡腎炎、60例原發性腎小球腎炎患者，分別符合美國風濕病學會（ACR）1997年SLE分類標準[2]和腎活檢確診為原發性腎小球腎炎、狼瘡腎炎的診斷標準。收集120例患者的血清、尿液、腎組織標本。所有腎活檢患者均為術前當天晨起留取清潔中段尿5mL，離心分離2mL，取上清液后置于20℃冰箱中保存，標本于3個月內檢測。納入標準包括：年齡 18～50 歲，平均年齡 39.7±7.5 歲；所有患者均自愿參與試驗并簽署知情同意書。經篩選符合試驗條件的受試者分別進入觀察組、對照組，觀察組）狼瘡腎炎患者男 11 例(18.3%)，女 49 例(81.7%)，對照組—原發性腎小球腎炎患者男性14例（23.3%），女46 例（76.7%）。

2 方法

2.1 細胞培養

為了確定TGF-β和Smad7的作用，用Smad7模擬物、Smad7抑制劑轉染之前或轉染之后的Smad7培養腎組織細胞。用 RPMI-1640（Life Technologies，CA，USA） 做細胞培養液，Smad7 要取相同量的血漿中所分離的，腎組織細胞來自于腎活檢患者提取的。

2.2 血清、尿液RNA分離

使用 TRIzol試劑（Takara，Dalian，China）分離來自外膜的總RNA

①培養細胞：外周血細胞 1-5×107，移入 1.5mL離心管中，加入1mL Trizol，混勻，室溫靜置5min；

②加入 0.2mL 氯仿，振蕩 15s，靜置 2min；

③4℃離心，12000g×15min，取上清；

④加入0.5mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；

⑤4℃離心，12000g×10min，棄上清；

⑥加入1mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清；

⑦晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10～15min）。

2.3 RNA逆轉錄為miRNA cDNA和總cDNA

使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（Takara，大連，中國）和 PrimeScript RT試劑盒（Takara，大連，中國）。

2.4 定量RT-PCR分析 （qPCR）各組腎組織TGF-βmRNA、Smad7mRNA 表達水平

使用Applied Biosystems 7500快速實時PCR系統實 時 PCR 系 統 （Applied Biosystems，Carlsbad，USA）和 SYBR Premix Ex Taq（Takara，Dalian，China）根據制造商的說明通過qPCR檢測mRNA和miRNA表達水平。并分別對GAPDH mRNA和小核RNA U6進行標準化。用2-ΔΔCt方法定量TGF-β和Smad7的Ct值。GAPDH內參照引物用DNA Club軟件設計，TGF-β及Smad7引物分別參照文獻[3]由上海生工生物工程公司合成序列如下。TGF-β上游引物為 5′CTTTAGGAAGGACCTGGGTT 3′，下游引物 5′CAGGAGCGCACAATCATGTT3'，擴增產物258 bp；Smad7 上游引物為 5′TCCTGCTGTGCAAA GTGTTC3′,下游引物為 5'AGTAAGGAGGAGGGGGA GAC3′, 產物為 164bp；GAPDH 上游 引物為 5′CTGGGC CGCTCTAGCCACCAA3′, 下游引物為 5′CTCTITGTATCACG CACGArITTC3′, 產 物 452bp。TGFβPCR 反應體系：5×PCR 緩沖液 5μL、MgCl2(25 mmol.L-1)O.5μl、dNTPs(10mmol.L-1)0.25μL、上游及 下 游 引 物 （25μmol.L-1） 各 0.5μl,cDNA 模 板3.5μl、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，補足雙蒸水至 25μL；Smad7 PCR 反應體系：5×PCR 緩沖液5μl、MgCI2(25mmol.L-1)0.5μl、dNTPs(10 mmol.L-1)0.25μL、 上游及下游引物 （25μmol.L-1） 各 1μL、cDNA 模板 2.5μL、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，補足雙蒸水至25μL。PCR擴增儀擴增，TGFβ條件為：94℃預變性 2 min，94℃變性 30s,50℃退火 30s,72℃延伸1 min,共循環30次，72℃終末延伸7min；Smad7改退火溫度為52℃,其余與TGFβ相同。

2.5 免疫組織化學方法

SP法,采用一步法免疫組織化學法檢測兩組患者腎組織中TGF-β、Smad7的表達,簡要檢測步驟為:①腎組織標本行冰凍切片，厚為5 μm,經丙酮(4 C預冷)固定15-30min；②加入0.2%皂索室溫放置30～45 min；③2%HO,室溫作用 15 min 去除內源性過氧化物酶；④加人試劑盒中特異性多聚酶標記的鼠源單克隆一抗4工過夜。以上各步驟之間均使用含0.02%吐溫-20的磷酸鹽緩中液(PBS)洗海至少3次每次5 min；⑤加人二氨基聯苯胺(DAB)應用液作用5～20 min,顯微鏡下終止顯色，蘇木素復染,封片,顯徽鏡下觀察結果。同時設立陰性對照:分別PBS代替一抗,其余步驟不變。

2.6 采用ELISA法

檢測血清和尿液中TGF-β、Smad水平，試劑由R&D公司提供,按1:100稀釋，操作嚴格按照說明書進行。

2.7 腎活檢

腎組織病理形態在B超引導下作經皮腎組織穿刺自動活檢術取出腎組織，所取腎組織長度為10～15mm，光鏡下觀察均有5個以上腎小球。腎組織標本采用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，制成2μm厚的切片，常規HE和PAS染色，由病理學專家根據診斷標準[14]作組織學診斷。

3 統計方法

采用SPSS20.0統計學軟件行統計學分析，計量資料采用均數±標準差(±s)的形式表示，計數資料用構成比表示，計量資料采用t檢驗的形式(組間比較)。相關性分析用Cox回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

4 結果

1）ELISA法檢測兩組患者血清中TGF-β的含量，觀察組較對照組含量高，P＜0.05，有統計學意義。（見表 1）

表1 兩組患者血清TGF-β的含量（±s）

表1 兩組患者血清TGF-β的含量（±s）

組別 OD 值 TGF-β（pg/mL）觀察組 0.416±0.019 500.3±98.7對照組 0.579±0.019 274.9±11.5

2）ELISA法檢測兩組患者尿液中TGF-β的含量，觀察組較對照組含量高，P＜0.01，有統計學意義。（見表 2）

表2 兩組患者尿液中TGF-β的含量（±s）

表2 兩組患者尿液中TGF-β的含量（±s）

組別 OD 值 TGF-β（ng/mgCr）觀察組 0.489±0.090 405.3±239.7對照組 0.937±0.158 77.1±40.8

3）RT-PCR半定量分析結果：TGF-β、Smad7 mRNA表達觀察組與對照組比較差異有顯著性 (P<0.05)，（見表 3）。

表3 各組腎組織TGF-β、Smad7mRNA表達的半定量分析（±s）

表3 各組腎組織TGF-β、Smad7mRNA表達的半定量分析（±s）

組別 TGF -βmRNA/GAPDHmRNA Smad7mRNA/GAPDHmRNA觀察組 1.55±0.78 0.83±0.04對照組 0.81±0.08 0.26±0.18

4）免疫組化半定量分析結果：患者腎組織TGF-β、Smad7蛋白主要表達在皮質腎小管上皮細胞內（如圖1所示）。TGF-β、Smad7蛋白表達觀察組較對照組均明顯增強(P<0.05)（如圖2所示，見表4）。

圖1 腎組織TGF-β、Smad7蛋白主要表達在皮質腎小管上皮細胞內

圖2 A對照組腎細胞TGF-β表達陰性對照,B觀察組腎細胞TGF-β陽性表達,C對照組腎細胞Smad7表達陰性對照,D觀察組腎細胞Smad7陽性表達

表4 兩組腎組織，免疫組化的半定量分析（±s）

表4 兩組腎組織，免疫組化的半定量分析（±s）

組別 TGF-β Smad7觀察組 3.80±0.73 2.02±0.33對照組 0.32±0.14 0.48±0.05

5 討論

眾所周知，TGF-β是調節腎臟纖維化的一個主要細胞因子。TGF-β造成腎臟纖維化可能通過以下幾種機制[4]：(1)減少了細胞凋亡；(2)直接使成纖維細胞或者其他類型細胞合成細胞外基質增多、分解減少；(3)促進其他類型的細胞轉變為成纖維細胞，從而造成更多的細胞外基質(ECM)沉積，損傷腎組織。TGF-β對纖維化起著決定性作用，其下游信號分子也發揮著協同或者是拮抗的作用。目前Smad3信號蛋白在維化中所扮演的角色最為清楚明了，越來越多的研究證實Smad3在組織的修復和纖維化的過程中發揮著重要的作用，比如：傷口的愈合，上皮細胞轉分化為間充質細胞以及各種肝臟、心臟、腎臟、皮膚、肺疾病過程中的瘢痕形成。TGF-β與胞膜上的TGF-β受體相結合后刺激Smad-3蛋白的基序SSXS磷酸化，并與Smad-2、Smad-4蛋白結合形成復合體，轉運至細胞核內，通過3種方式 (直接與DNA結合、與其他DNA結合蛋白結合、與轉錄共激活子結合)調控轉錄，參與細胞生長、分化、凋亡[5]，在腎臟則表現為各型膠原、纖維連接蛋白、a—sma表達增加[6]，細胞外基質合成減少，分解增加，腎小管硬化，腎間質纖維化[7]。綜上所述，現認為LN患者血清可刺激HK-2細胞分泌TGF-β，作用于細胞表面TGF-β受體，再經過細胞內的一系列信號轉導，增加了纖維化信號通路上信號蛋白Smad3的磷酸化，相關表型蛋白表達增加，ECM沉積，腎臟纖維化。

以往的研究均表明，Smad4對Smads信號通路依賴型靶基因的激活至關重要，它是目前在哺乳動物中發現的唯-Co-Smads。Smad7在其他腎臟疾病中的表達有學者作過研究，但結果不盡相同。Fukasawa等[8]在大鼠腎梗阻模型(UUO)研究中發現，隨著UUO大鼠腎小管間質纖維化的進展，Smad 7mRNA表達水平不斷增高,而蛋白表達水平卻降低，進一步研究顯示,可能由于Smad的泛素調節因l、2(Smad ubiquitin regulatory factorsSmurfs)，也稱 E3泛肽酶 (E3 ubiquitin ligases表)達水平增高,導致Smad7蛋白的降解和泛肽化活性顯著增強。Uchica等[9]在腎小球膜增生性腎炎大鼠模型 (anti-Thylnephriti中s)發現 Smad7在腎小球表達降低，但Ostendorf等[10]卻在相同的模型中得到了相反的。

國內王美美團隊在狼瘡鼠模型[11]的實驗結果顯示，慢性GVHD LN小鼠腎組織均檢測到Smad4及Smad7mRNA和蛋白的表達，LN小鼠腎組織Smad蛋白及mRNA的表達均顯著高于正常腎鼠模型組(P＜0.05)。對這一實驗結果的可能解釋：(1)以往她們團隊的研究[12]在LN腎組織中TGF-β的表達水平顯著增高,Smad4作為TGF-β下游信號傳導的承擔者，隨著腎臟纖維化病程不斷惡化和TGF-β表達增強而增強；另外，Smad7基因啟動子區包含1個Smad3-Smad 4復合物的結合序列(GTCTAGAC)，因此TGF-β和Smad4表達水平增強會顯著上調Smad7的表達；(2)近來研究發現，Smads信號通路的抑制物（如：SnoN和Ski等）在纖維化的腎臟中表達水平降低[13]，提示Smads抑制物表達的降低可能是腎臟纖維化中Smads表達增高的重要機制；(3)Smad7在LN腎組織中的表達增強，但內源性Smad7的表達卻不足以抑制纖維形成反應，因為TGF-β對內源性Smad7表達的刺激不足以克服其活化R'Smads而產生的纖維化效應，對此的可能解釋是Smad7表達的基本水平 （即使受到刺激時）能阻止R-Smads介導TGF-β效應，這一監控形成了一個內源性Smad7表達的刺激閾值，超過這一閾值則發生纖維形成反應[14]，而可能通過一個適當的載體系統（如：轉染Smad7基因）[15]使 Smad7異位表達，這可能是治療腎臟纖維化的一種手段。

本文通過細胞培養、ELISA、PT-PCR、免疫組化的檢測均表明LV腎組織均有TGF-β、Smad7的表達，且表達高于原發性腎小球腎炎患者。這說明LN腎損害炎癥因子參與的過程中，有TGF-β/Smad7這一信號通路的作用參與。LN病人TGF-β/Smad7異常是腎損傷產生的分子基礎，并為LN免疫干預治療提供理論依據。