肉雞H9亞型禽流感繼發(fā)細菌感染的診斷

李 曄 康佳楠 郭文潔

沈陽工學院，沈陽113122

1 病理剖檢

死淘肉仔雞20 多日齡，個體大小及重量差異較大，死淘雞肛門處羽毛污穢黃染。剖檢病死雞氣囊增厚，表面有纖維素滲出物，有心包炎和肝周炎，喉頭、氣管黏液增多，泄殖腔黏膜有出血條帶，有部分病死雞肺臟淤血，有灰白色壞死灶。

2 實驗室檢測

2.1 樣品采集與運送

無菌采集10 只死淘雞喉氣管、心、肺、肝、脾、腎和泄殖腔等組織，每份組織樣品單獨盛放，每只雞采集的所有組織樣品形成一個包裝和編號，包裝好的樣品4 h 內冷藏運輸到獸醫(yī)實驗室。

2.2 細菌學檢驗

心、肝、脾、肺等實質臟器涂片，革蘭氏染色鏡檢均發(fā)現G-桿菌，將麥康凱瓊脂和TSA 瓊脂用直徑15 mm 的平皿制成3 mm 厚的平板，分成心、肝、脾、肺4 個區(qū)。燒烙心、肝、脾、肺組織的表面，用滅菌剪剪開，心臟要剪至露出心內膜，用接種環(huán)勺取少量各種組織，按組織類別分別在麥康凱瓊脂和TSA 瓊脂平板上分好的區(qū)內劃線，接種好的培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，結果9 份實質臟器樣品在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上分離到了粉紅色不透明、圓整、隆起的中等大小菌落，采用腸桿菌科微量生化管鑒定為大腸埃希氏菌；2 份肺臟樣品在TSA 瓊脂上分離到圓形、濕潤、大而扁平的菌落，細菌產綠色素，48 h 后整個培養(yǎng)基變成暗綠色，用非發(fā)酵菌微量生化管鑒定為銅綠假單胞菌。分離到的大腸埃希氏菌與銅綠假單胞菌純化菌株如圖1、圖2所示。

圖1 大腸埃希氏菌在麥康凱培養(yǎng)基上的粉紅色菌落

圖2 銅綠假單胞菌在TSA 瓊脂上產綠色素

2.3 分子生物學檢驗

核酸提取與純化試劑、H9AIV 核酸檢測試劑（RT-PCR 熒光探針法）均為中山大學達安基因股份有限公司提供。將喉氣管和泄殖腔組織剪碎、研磨，按1∶5 加入PBS 制成勻漿，將勻漿轉入離心管中3 000 r/min 離心10 min，取上清液轉入Eppendoff管中準備進行病毒核酸提取和檢測。Total RNA 提取采用離心柱法：取組織勻漿上清液100 μL，加入裂解液600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置5 min，將液體轉移至吸附柱中（吸附柱要套上收集管），13 000 r/min 離心30 s，棄去收集管中液體，加入600 μL 洗液，13 000 r/min 離心30 s，如此重復洗滌1 次，洗滌完成后離心去除殘留的洗滌液。將吸附柱移入新的離心管中，向柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，13 000 r/min 離心30 s，則離心管中收集的液體為洗脫的RNA 溶液。H9AIV核酸檢測采用熒光RT-PCR 方法，一步法RT-PCR反應條件為：50 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；94 ℃15 s，58 ℃45 s（在該點收集熒光，熒光探針檢測模式為FAM），40 個循環(huán)。結果判定：檢測樣品的擴增曲線無對數增長期或Ct值＞37，判為H9AIV 陰性；檢測樣品Ct值≤37，擴增曲線有明顯的對數增長期，判為H9AIV 陽性。經檢測有7 份樣品H9AIV 核酸陽性，H9AIV 核酸擴增曲線見圖3。

圖3 H9AIV 核酸熒光RT-PCR 曲線

3 小 結

本肉雞群死淘率偏高、投喂抗生素時好時壞的根本原因是存在H9AIV 感染，導致細菌病繼發(fā)不斷。本病例同時分離到了大腸桿菌和銅綠假單胞菌，均為條件致病菌。單獨感染H9AIV 的雞群通常發(fā)病率高，但一般呈溫和經過，H9AIV 往往在其他病原的協同作用下造成禽類大批死亡和產蛋嚴重下降。一般種雞通過接種H9AIV 滅活疫苗預防該病，所產的商品雞可獲得較高水平的母源抗體，10日齡前獲得保護，商品蛋雞可在10日齡、40日齡、23 周齡進行3 次H9 亞型禽流感（H9AI）免疫，使蛋雞在育雛、育成、產蛋期都保持良好的抗體水平。但是白羽商品肉雞由于飼養(yǎng)周期短、飼養(yǎng)量大、雞肉品質要求等原因無法進行H9AI 免疫，一旦感染H9AIV 會導致雞群免疫力低下、呼吸系統(tǒng)屏障損傷，進而細菌病多發(fā)。投喂抗生素不能從根本上解決問題，還會導致雞肉制品抗生素殘留以及耐藥菌株的產生，因此白羽肉仔雞場對H9AIV 關鍵是“防”，尤其是肉仔雞11日齡后，母源抗體趨于消失時要密切落實隔離消毒工作，在H9AI 易發(fā)的冬春季節(jié)加強飼養(yǎng)管理，禽舍溫度要保持在18～22 ℃，濕度50%～60%，可在禽舍有代表性的位置懸掛溫濕度表，同時要合理通風換氣，保持空氣清潔無氨味，避免肉仔雞呼吸道屏障受損，為病毒侵入打開門戶。此外，雞新城疫和雞傳染性支氣管炎感染的臨床癥狀易與H9AI 相混淆，而且易與H9AI 發(fā)生混合感染，因此要做好雞新城疫和雞傳染性支氣管炎的聯合預防，最好采用HA/HI 試驗和ELISA 試驗對肉雞養(yǎng)殖場的禽群開展抗體檢測，根據檢測結果制定和調整免疫程序。