海蘭商品蛋雞白血病與馬立克氏病混合感染案例分析

李丹陽 楊恒達 王新衛

河南農業大學牧醫工程學院，鄭州450002

馬立克氏?。╩arek’s disease，MD）是最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病，以外周神經和包括虹膜、皮膚在內的各種器官和組織的單核性細胞浸潤為特征。該病傳染性強，常給家禽生產帶來嚴重損失。禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽類的多種腫瘤性疾病的統稱，在自然條件下以淋巴白血病最為常見，世界各地均有本病存在，大多數雞群均有感染，但出現臨診癥狀的病雞數量較少[1]。ALV 有2 種傳播方式：水平傳播和垂直傳播。大多數雞通過與先天感染雞的密切接觸獲得感染，從而給后來的生產帶來不可估量的損失[2-3]。網狀內皮組織增生癥病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）屬哺乳動物C 型反轉錄病毒屬，只有1 個血清型，除引發腫瘤外，常在感染雞群中引起嚴重的免疫抑制或免疫耐受[4]。這3 種病毒在生產中可以單獨感染，也可以二重或三重混合感染，引起雞群嚴重的免疫抑制，繼之誘發細菌性及其他病毒性感染[5]，給雞群造成更大的損失。近幾年，地方蛋雞和肉雞均有MDV 和ALV的混合感染報道，但在海蘭蛋雞中MDV 和ALV 的混合感染卻少見報道。

2017年5月，南陽某養殖場雞群從80日齡出現發病癥狀，并出現死亡，至113日齡時雞群仍不斷死亡。養殖場主隨即來農大禽病所就診，經臨床癥狀、剖檢變化、分子生物學診斷等方法將該病例確診為禽白血病與馬立克氏病混合感染。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）病例。河南南陽某雞場海蘭蛋雞10 000 羽，發病雞群為113日齡，雞群從80日齡發病并出現零星死亡，零星死亡一直持續到100日齡（每天死亡1～2 只），100～113日齡每天死亡5～8 只。但雞群大體精神尚可，典型的變化是不斷有弱雞出現，這些雞精神沉郁、采食量低，極度消瘦或趨于消瘦；雞冠蒼白、皺縮，有的病雞可觸摸到腫大的肝。

2）主要試劑。DNA Marker DL 2000、Taq DNA聚合酶、RRI、M-MLV 反轉錄酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA 提取用Trizol LS Reagent購自Invitrogen 公司；瓊脂糖購自BIOWEST AGAROSE 公司。

3）主要儀器。生物安全柜、酶標儀購自Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 儀購自北京東勝創新生物科技有限公司；ECP3000 三恒多用電泳儀購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像系統購自美國Alpha Innotech 公司；Univeral 32R 高速冷凍離心機購自德國Hettich 公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋購自國華電器有限公司。

1.2 方 法

1）臨床癥狀觀察。詢問養殖戶以及現場觀察病雞，并記錄發病癥狀。

2）剖檢病變觀察。按照病理學常規方法剖檢病死雞，并記錄其典型的病理變化。

3）病毒分離鑒定。

①MDV 的分離及引物設計。將來自河南南陽某雞場的腫瘤病送檢病料（脾和腫瘤組織）用研磨器無菌研磨（8 000 r/min，5 min），按病料1∶5 加入PBS 液，病料反復凍融3 次備用。然后采用酚—氯仿抽提法提取患病組織DNA，同時設計1 對特異性引物如下，MDV UL19 P5 上游：5′-CCCGATATTATCATTKCHCC-3′和MDV UL19 P6 下游：5′-CTCGCATTATTATCT GAAGT-3′，擴增的DNA 片段預期長度為521 bp。

②ALV 和REV 的分離及引物設計。因其出現貧血及腫瘤現象，利用組織血液RNA 提取試劑盒提取患病組織RNA，經反轉錄成cDNA。設計合成1對針對ALV 特異性引物如下，ALVgp85 U2 上游：5′-GCCACC TCCCCT TTTCAA-3′和ALVgp85 L2下游：5′-GAA AAT TSC GGGTGGTAGC-3′，擴增的DNA 片段預期長度為778 bp。同時，設計1 對REV 特異性引物如下，REV-1 上游：5′-CAT ACTGGAGCCAATGGTT-3′和REV-2 下游：5′-AATGTTGTACCG AAGTAC T-3′，擴增的DNA 片段預期長度為291 bp。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

病雞主要癥狀為張嘴呼吸，雞冠發白，腳爪干瘦無光澤（圖1），精神沉郁、消瘦（圖2）。同時，可見部分病雞虹膜受到侵害導致失明，一側或兩側虹膜不正常，色彩消退。

2.2 病理變化

剖檢病雞主要見內臟腫瘤：肝臟腫大，見有多個腫瘤結節，結節呈紐扣狀或其他形狀，大小不一，遍布肝臟（圖3）；脾臟腫大，可見腫瘤增生（圖4），腎臟局部腫大，腫瘤結節可見（圖5），個別肺部也出現腫大。

2.3 病毒分離鑒定結果

圖1 腳爪干瘦無光澤

圖2 病雞消瘦

圖3 肝臟腫大有明顯結節

圖4 脾臟重度腫大

圖5 腎臟腫大

1）MDV 的PCR 鑒定。以提取的DNA 為模板進行PCR 擴增，產物的凝膠電泳結果顯示在約521 bp 出現清晰的目的條帶（圖6），與預期的產物片段大小一致，即MDV 陽性。

圖6 MDV PCR 擴增結果

2）ALV 和REV 的PCR 鑒定。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，產物的凝膠電泳結果顯示在約778 bp處出現清晰的目的條帶（圖7），與預期的產物片段大小一致，即ALV 陽性，但在291 bp 處未呈現相應條帶（圖8），即REV 陰性。

圖7 ALV PCR 擴增結果

根據該雞場雞群的發病情況、臨床癥狀、病理剖檢變化、PCR 及RT-PCR 結果顯示MDV 陽性、ALV 陽性、REV 陰性等綜合分析，可確診該發病雞群為馬立克氏病病毒和禽白血病病毒混合感染。綜合以上檢查結果，確診該雞場雞群混合感染了馬立克氏病病毒和白血病病毒。

3 討 論

圖8 REV PCR 擴增結果

根據該雞場雞群的臨床表現：雞群精神沉郁、消瘦、雞冠發白、腳爪干瘦，發病日齡從80日齡至送診時不斷有病雞出現，而且病理剖檢可見肝臟、腎臟等臟器腫瘤結節，結合實驗室的PCR 檢測結果證實該商品海蘭蛋雞群感染了馬立克氏病病毒和禽白血病病毒。

馬立克氏病、禽白血病和網狀內皮組織增生癥均為禽病中常見的病毒性腫瘤病[6]，它們均可引起免疫抑制，也可共感染或引起繼發、混合感染，導致雞群生產性能下降等[7]。這些疾病在我國沒有凈化的雞群中更為常見[8]。但近年來，其中的2 種疾病共感染在海蘭凈化雞群中發生還是不多見[9]，而對于該海蘭雞群發生MD 和AL 共感染的原因值得思考。在本病例中，MD 發生的可能原因有：環境存在強毒導致疫苗毒不能保護雞群，或者漏防，或者母源抗體干擾，此外也不能排除種雞群攜帶白血病病毒，引起子代雞先天性感染干擾MD 疫苗的免疫而引起MD 發生。而對白血病，我國海蘭蛋雞，尤其引進的祖代雞都進行了白血病凈化。商品代海蘭蛋雞白血病的發生和流行率很低，發病病例也很罕見。而本病例的海蘭商品代蛋雞感染白血病的原因值得探究。養雞場主反映，發病雞為引進青年雞，對雞苗的來源與免疫情況不了解，賣方僅說要求防疫的疫苗均做了防疫，該批青年雞的父母代種禽來自質量可靠的大廠家。但該病傳播方式為垂直傳播和水平傳播，雞群感染并發生白血病的最可能原因是種雞帶毒、孵化室污染或者后來使用了劣質疫苗（存在白血病病毒污染的疫苗等）[10]，但具體是何種風險因子導致，因涉及多個廠家，使用的疫苗也不明晰，無法進行流行病學追蹤。

為進行鑒別診斷，筆者進行了REV 的檢測，發現為陰性，而MDV 和ALV 陽性，進一步排除了REV，支持了MD 與AL 共感染。這說明在實際家禽生產中還存在很多生物安全隱患，導致這些腫瘤性疾病發生；也暗示我國種禽場需要進一步加強這些疾病的凈化，同時也應加強對生產活疫苗廠家的監管，以防通過劣質疫苗引入這些疾病給雞群；更需要注意的是商品代養殖戶要提高自身的生物安全措施和管理水平，以便共同防控疫病，為家禽生產提供保障。