大鼠基底外側杏仁核對恐懼視覺信息的編碼分析

李曉媛, 劉 允, 司紅玉, 武 鵬, 王振龍

(1.鄭州大學電氣工程學院，鄭州 450001；2.鄭州大學體育學院，鄭州 450001；3.鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001)

視覺是動物獲取外部世界各類信息的重要途徑之一，經過視覺系統攝取的信息占動物總體獲取感知信息的80%以上[1]，其中恐懼視覺信息的感應獲取和快速識別是大腦預警的基本功能。但是過度的恐懼記憶會給生物的身心造成不可磨滅的傷害[2]，如創傷后應激障礙等。生物在面臨危險情境時或者感知到天敵時形成的快速無意識逃避的能力，是其保持生存的必要手段，對于動物逃避危險以及獲得生存機會有關鍵作用。遺傳學證明，動物視覺基因中帶有祖先遺傳下來的恐懼信息，能夠無意識地感知危險情境并進行自我保護[3]。然而在生物成長過程中，自然界不斷襲來各式各樣的危險，因此，動物需要在后天成長中不斷進行各種學習并儲存經驗，習得恐懼視覺聯結[4]，增加遇到危險狀況時的成活概率。基底外側杏仁核(BLA)，是杏仁核(Amygdala，AMG)底部外側的神經元集群簇[5-6]。已有研究表明，BLA是哺乳動物恐懼視覺信息的表征中的關鍵腦區。因此，研究BLA在條件性恐懼視覺形成過程中對視覺刺激圖片的響應表征，對于解析哺乳動物在面臨危險刺激時，大腦是如何快速感知和識別危險恐懼信息，以及清楚解析哺乳動物大腦進化過程中的自我保護機制具有重大意義。

Fox等[7]通過激活恐懼應激前的BLA核團內的谷氨酸能受體，發現恐懼應激行為明顯變弱。Schweckendiek等[8]通過核磁共振功能成像技術研究恐懼應激障礙患者接受恢復治療期間AMG的活躍度，結果表明經過治療后患者相對正常人明顯異常活躍的AMG激活程度顯著降低。2013年，Strawn等[9]發現恐懼應激狀態下的杏仁核谷氨酸酶能受體含量遠遠高于正常狀態的BLA核團，谷氨酸能受體能夠顯著降低大鼠對恐懼事物的逃避情況。Kim等[10]利用光遺傳技術證實了BLA腦區的神經元細胞在情緒記憶形成過程中發揮的重要作用，證明AMG核團中的BLA亞區負責編碼恐懼情緒。Shi等[11]發現BLA區作為響應處理恐懼信息的關鍵神經簇，它的信息處理工作主要是利用分泌多巴胺受體來進行的，從生物大分子的基礎上探究BLA腦區進行恐懼信息響應處理的機制。

Schafe等[12]的研究證明，BLA的突觸可塑性參與恐懼相關的認知學習記憶任務，且恐懼認知學習記憶過程中BLA腦區細胞放電規律性增加。Paton等[13]通過對猴子視覺認知過程中BLA區獎勵和懲罰的視覺刺激時的神經元響應進行研究分析，證明BLA區單神經元能夠有效響應不同情緒背景的視覺信息。Bergstrom等[14]采用巴普洛夫原理建立大鼠條件性恐懼視覺聯結，利用光遺傳技術分析條件性恐懼視覺情緒在杏仁核的響應特性，結果表明，AMG中存在部分神經元能有效響應條件性恐懼視覺刺激信息[15]。近年來，越來越多的研究表明，BLA區的神經元很有可能是通過集群響應的方式編碼恐懼信息的。因此，從神經元集群的角度對大腦BLA區恐懼信息進行編碼研究對探究神經科學領域中恐懼信息響應處理的機制具有重要意義。

根據上述問題，針對恐懼視覺圖片信息的快速響應任務，設計基于自然圖像的恐懼訓練實驗范式，以LE大鼠為實驗動物，采集BLA腦區的多通道神經信號，提取Spike信號的發放率和信息熵進行集群編碼響應分析，最后利用貝葉斯分類器進行解碼判斷，分析LE大鼠BLA腦區對恐懼視覺信息的響應特性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為清潔級雄性Long Evans(LE)大鼠3只，體重220～280 g，10～14周齡，從中國科學院上海生命科學研究院萊斯科實驗動物有限責任公司引進，由河南省實驗動物中心進行飼養繁殖，濕度維持在(60±5)%，噪聲85 dB以下，通風換氣，所有實驗大鼠均從幼年期開始接觸實驗人員。所有實驗大鼠均經過課題組自主研發的嚙齒類動物視覺認知行為功能自動化測評系統測試篩選，視力正常。研究內容所涉及的動物飼養及訓練過程嚴格遵循國際及國家頒布的有關動物倫理研究的要求，經鄭州大學生命科學倫理審查委員會審查合格。

1.2 慢性微電極植入

首先，按照0.25 mL/100 g的標準對大鼠腹腔注射1.5%的戊巴比妥鈉麻醉劑；然后，將大鼠固定在腦立體定位儀上，在大鼠頭皮上注射0.01 mL利多卡因。參照大鼠腦定位圖譜定位微電極植入位置為BLA(anterior-posterior, A-P: -2.16～-2.9 mm; medial-lateral, M-L:4.40～5.20 mm; dorsal-ventral, D-V: -6.82～-7.80 mm)，植入MWEA 4×4微電極陣列。最后用牙科水泥覆蓋固定電極，縫合頭皮傷口，在傷口涂抹抗生素消毒。連續3 d腹腔注射0.2 mL的拜有利注射液進行術后消炎護理。

1.3 實驗設備

動物行為訓練系統硬件部分為一個大鼠行為認知學習訓練箱，如圖1所示，可對大鼠進行恐懼視覺聯結。尺寸為50 cm×30 cm×30 cm，左右后側為不銹鋼墻壁，左側正中裝有出水口進行糖水獎勵，，前側有機塑料材質的可開關的透明門；頂部由正中安放紅外攝像頭的透明蓋子密封，底部為等間距的銅柵，可設置通電參數進行電擊。軟件控制部分為安來軟件科技有限公司設計的LabState軟件，負責設置實驗參數、大鼠狀態信息、圖像采集、數據分析等，能夠實現動物行為實時監控、分析和設計實驗范式等功能。

圖1 動物行為訓練箱體Fig.1 Animal behavior training box

圖2 實驗流程Fig.2 Experimental procedure

1.4 實驗范式設計

在大鼠BLA腦區植入電極護理5～7 d后開始訓練。具體訓練過程分為兩個階段，如圖2所示。第1階段：獎勵訓練階段，此階段目的為使大鼠學會看圖片；實驗開始，黑屏5 s后在屏幕中央固定區域顯示“○”圖像(400×400像素)5 s，“○”圖像出現3 s后出水口出糖水2 s(0.1 mL)，黑屏進入下個試次。第2階段：認知抉擇階段，使大鼠學會辨別獎勵“○”、中性“△”和恐懼“蛇”圖片，并進行對應的行為抉擇。將訓練箱底部通電柵欄分為不通電的安全區和通電的電擊區。實驗開始，黑屏5 s后在屏幕中央固定區域隨機顯示“○”圖像、“△”圖像或者“蛇”的圖像5 s，圖像出現3 s后給出對應條件性刺激2 s(蛇：足底電擊；○：糖水)，記錄大鼠對應的抉擇動作，黑屏進入下次試次。抉擇正確評價標準：“○”圖像出現3 s后，若大鼠移動到出水口喝水則視為抉擇正確；“蛇”圖像出現3 s后，若大鼠從電擊區逃至安全區或在安全區不動則視為抉擇正確；“△”出現5 s，大鼠未有動作則視為抉擇正確。

1.5 神經信號采集與處理

一系列動物情緒視覺認知實驗表明，從單神經元的響應特性上難以有效地解釋恐懼視覺信息在皮層下視通路中的響應特性，神經元集群放電活動則能很好地表征大腦的響應特性，并且在特定的外界信息刺激下，能夠對外界輸入信號攜帶的信息進行特征響應和信息解碼傳遞，借助電位變化進行不同核團之間的信息傳遞。因此，基于以上原理，利用美國Blackrock Microsystem公司研發生產的Cerebus多通道信號記錄儀采集植入電極后的大鼠訓練前、后兩個階段不同屬性(獎勵、中性、恐懼)圖像刺激時的Spike信號。然后，從發放率和信息熵兩方面解析基于Spike信號的神經元集群響應特性，從而得到不同屬性視覺圖片刺激與神經元集群Spike信號發放之間的聯系。

1.5.1 神經元集群Spike發放率編碼原理

在給定的外界視覺刺激下，BLA腦區若干個神經元會同時出現Spike發放率增加的現象。通過提取Spike發放率的特征，設置固定的時間窗，取每個時間窗為一個Bin，如圖3所示，計算神經元在單位時間窗的Spike發放總數，從而獲得恐懼視覺信息傳遞過程中的神經元集群發放頻率，解析大鼠BLA腦區在恐懼視覺建立過程中的神經元集群響應特性。具體步驟如下。

(1)設置參數時間窗Δt。Δt=ti+1-ti，i=1,2,…,m-1,m，m為每個試次時刺激時間窗個數，參數時間窗大小設置為Δt=0.1 s。

(2)記錄每次刺激時間段的平均周期內單個神經元在時間窗(ti,ti+1)內的發放總數，記為si(ti,ti+1)，計算該時間窗內Spike發放率為

(1)

(3)重復步驟(2)，計算n個神經元每個試次內的Spike發放率，記為rij(j=1,2,…,n-1,n)，多個神經元Spike發放率的平均值為

(2)

圖3 Spike發放率提取原理Fig.3 Spike emission rate extraction principle

(4)以大鼠N1為例，每組實驗共進行15個試次，訓練前后每個試次可采集到12個有效發放的神經元。以視覺信息刺激時間為橫軸，試次為縱軸，顏色深淺代表神經元發放頻率的高低(越黑代表發放越高)繪制神經元集群Spike發放率變化圖。

(5)計算每個Bin中15個試次內的Spike發放總數集合，繪制Spike發放總數散點圖并進行高斯擬合，觀察神經元集群Spike發放總數對視覺信息刺激隨著時間的編碼情況變化。

(6)進一步均值化處理神經元集群Spike發放率，對采樣的Spike發放率進行最小二乘法擬合，觀察分析神經元集群Spike發放率隨著時間軸的變化趨勢。

1.5.2 神經元集群信息熵編碼原理

神經元集群的電生理信號發放是非線性的，信息熵能夠表征在特定時間窗內協同合作的神經元集群的非線性動態特征。因此，也利用非線性的信息熵特征來分析恐懼視覺信息在大鼠BLA腦區的動態響應特性。根據信息熵的定義，信息熵計算步驟如下。

(1)設置時間窗。Δt=ti+1-ti，其中i=1,2,…,m，m為刺激時間內包含時間窗個數，設時間窗Δt=100 ms，從而得到單神經元其中一個時間窗的Spike發放序列。

(3)

(3)計算神經元集群Spike發放序列的熵：

(4)

(4)重復上述步驟，計算每個時間窗的熵Ei。

(5)重復試驗m次，統計每次試驗的熵序列，按照時間窗對應位置進行均值化處理：

(5)

按照上述步驟計算大鼠條件性恐懼視覺聯結建立前后，BLA腦區對不同屬性的圖形刺激的神經元集群發放信息熵，繪制相關黑白熱點圖并觀察信息熵變化情況。

1.6 構建貝葉斯模型對解碼效果進行驗證

選擇樸素貝葉斯模型對所提取到的神經元集群響應進行解碼。即從采集到的未知刺激屬性神經元放電規律中判斷出其對應的視覺刺激屬性(圖4)。為了驗證解碼效果的準確性，以大鼠N1的BLA腦區響應已知不同視覺刺激的神經元集群特征為訓練集，以N2、N3大鼠未知視覺刺激類型時的神經元集群響應特征為測試集進行聯合特征解碼驗證。然后統計兩種刺激屬性的解碼正確率。

圖4 基于神經元集群響應的刺激圖形解碼Fig.4 Stimulus graph decoding based on neuron cluster response

1.6.1 貝葉斯分類解碼器

貝葉斯(Bayes)分類是一類分類算法的總稱，這類算法均以貝葉斯定理為基礎，故統稱為貝葉斯分類。貝葉斯理論的側重點是“知果求因”，即已經知道結果，反過來探究原因發生的概率。主要討論基于樸素貝葉斯的理論，對于給出的待分類項，求解在此項出現的條件下各個類別出現的概率，哪個最大，就認為此待分類項屬于哪個類別。具體算法流程如圖5所示。

圖5 樸素貝葉斯算法流程Fig.5 Naivebayes algorithm flow chart

2 結果

一共使用3只LE大鼠進行上述基于自然圖像的條件性恐懼視覺聯結訓練，采集3只大鼠BLA腦區(12個神經元)對不同屬性圖形刺激響應的Spike信號，進行神經元集群發放率以及信息熵響應特性分析，再根據神經元集群響應特征運用貝葉斯分類器進行解碼分析。所有數據處理均在MATLAB2014a和SPSS20.0中進行。

2.1 BLA區Spike發放率響應的自然恐懼視覺特性分析

圖6 訓練前后對不同屬性圖片刺激的神經元集群Spike發放率響應Fig.6 Response of Spike rate stimulated by different attribute patterns before and after training

以其中一只大鼠N1為例，展示了在恐懼視覺建立前后的神經元集群針對不同屬性視覺刺激的Spike發放率響應特征情況，如圖6所示。橫軸代表時間，每個單位長度為一個Bin，一個Bin為100 ms，0表示圖像刺激出現的時刻，縱軸依次為實驗試次(共15個試次)、每個Bin內15試次的發放總數、每個時刻的Spike發放率，紅色框圈出不同屬性圖片刺激顯示時間。

由圖6可以看出，恐懼視覺訓練前后，大鼠BLA腦區Spike發放響應變化最大，在恐懼圖形刺激的1 s內Spike發放率最高。由獎勵圖像刺激引起的Spike發放率變化微弱且不穩定。中性圖像刺激則未能引起Spike發放的明顯變化。說明經過條件性恐懼視覺聯結訓練后，大鼠BLA腦區對恐懼視覺信息形成了有效的Spike發放頻率響應，與恐懼視覺信息的響應處理密切相關。

統計3只大鼠訓練前后采集到的BLA腦區神經元集群響應不同屬性視覺刺激時的所有Spike發放，利用SPSS 20.0軟件進行統計分析，用t檢驗來確定組間的統計學意義，其中P<0.05表明統計結果具有顯著性差異。統計分析結果如表1所示，對于圖形刺激的神經元集群Spike發放，訓練前3種圖像刺激之間無顯著性差異，訓練后，恐懼與獎勵和中性間均有顯著性差異，獎勵與中性之間無顯著差異。表明3種圖像本身特性在BLA中的響應不存在差異，大鼠BLA腦區經過行為學訓練能夠有效認知恐懼屬性的圖形，而無法對獎勵和中性圖形形成有效認知。實驗證明，大鼠基底外側杏仁核BLA腦區對恐懼圖形形成了有效的視覺信息響應，而對獎勵與中性圖形則無有效的信息響應特性形成。

表1 不同屬性圖片引起的神經元集群響應差異性對比Table 1 Contrast of neuron cluster response caused by different attributes images

2.2 BLA區編碼自然恐懼視覺的信息熵特性分析

以其中一只大鼠N1(12個神經元)為例，BLA腦區在基于自然圖形的條件性恐懼視覺聯結訓練前后，對不同屬性的視覺圖形刺激響應的神經元集群信息熵編碼(圖7)。圖中橫軸為時間(0為圖形刺激開始時刻)，縱軸依次為12個神經元的編號，顏色深淺代表響應強度的高低，顏色越接近白色則響應強度越高，紅框圈出部分為持續1 s的圖形刺激出現時間段。

從圖7和圖8的對比中可以看出，經過行為學訓練，LE大鼠BLA腦區神經元集群對帶有恐懼屬性的自然圖像響應的信息熵明顯增強，且高強度的神經元集群信息熵變化集中在圖形刺激的1 s內(紅色矩形框圈出的部分)，對獎勵屬性的圖像響應有微弱但不規律的增加，對中性屬性的圖像響應無明顯變化。故此實驗結果證明，LE大鼠BLA腦區神經元集群對恐懼屬性的自然圖形形成了信息熵響應。

圖7 訓練前獎勵、恐懼、中性刺激的集群信息熵Fig.7 Cluster information entropy of pre-training reward, fear and neutral stimulus

圖8 訓練后獎勵、恐懼、中性刺激的集群信息熵Fig.8 Cluster information entropy of pro-training reward, fear and neutral stimulus

根據多次實驗提取的神經元信息，計算得到集群熵，并用SPSS20.0進行統計分析，結果如表2所示。恐懼視覺聯結訓練前，3種屬性刺激圖片引起的BLA神經元集群響應信息熵值之間無顯著性差異，說明3種視覺刺激圖片本身不能引起BLA腦區的神經元響應差異。訓練后，恐懼與獎勵和中性引起的神經元集群熵之間均有顯著性差異，然而，獎勵與中性圖片引起的神經元集群熵之間無顯著性差異。實驗證明，大鼠BLA腦區在恐懼視覺聯結之后僅僅對恐懼圖片刺激形成了有效的視覺信息響應。

2.3 貝葉斯模型解碼結果

對恐懼和非恐懼刺激解碼正確率如表3所示，兩種視覺刺激的解碼正確率均達到90%以上，證明本文所提取的兩種神經元集群響應特征的有效性，以及樸素貝葉斯分類方法理論對于神經信息解碼的有效性。

表2 不同屬性圖片引起的神經元集群熵值差異性對比Table 2 Contrast of neuron cluster entropy caused by different attributes images

表3 樸素貝葉斯解碼正確率Table 3 Accuracy rate of naive bayes decoding

3 結論

結合動物行為學和神經電生理學，在恐懼視覺聯結形成前后，提取大鼠BLA腦區的神經元集群響應特征：Spike發放率、信息熵，研究恐懼視覺形成前后大鼠BLA腦區的神經元集群響應，并且利用樸素貝葉斯分類方法進行解碼驗證，正確率均達到90%以上，驗證了此解碼方法的有效性。本文的研究能夠推動BLA在快速響應恐懼信息過程中關鍵作用的研究，并且在恐懼情緒視覺認知領域展開了探索，相應的信息快速處理機制能夠為目標快速識別提供思路。本文的不足之處將在以后的研究中進行改進和完善，主要有以下兩方面。

(1)恐懼“蛇”圖片刺激未精細化劃分為高頻、低頻、以及朝向等特征，未從多個角度探究大鼠BLA腦區神經元集群究竟是刺激圖像的哪種特征進行編碼表征的。

(2)響應特征提取方法較為單一，僅從Spike發放率、信息熵兩個特征進行解析，以后應該嘗試采用其他方法來提取并表征恐懼視覺刺激前后的神經元集群放電規律。