延胡索丁素對大鼠心肌梗死的保護作用及機制研究

林岳 姜盈盈 呂望 金煥治 陳玲瓏

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）作為心血管急重癥，在臨床較為常見。因其冠狀動脈阻塞持續影響心肌供血，最終誘導心肌壞死［1］。AMI具有發病急促、病情嚴重、病死率高等特點，可導致惡性心律失常、室間隔穿孔、心臟破裂或猝死等癥狀［2］。中醫藥對于心肌梗死的臨床治療具有悠久歷史，可通過多靶點、多途徑改善AMI后心肌損傷，增強心功能及緩解患者癥狀。中藥延胡索為罌粟科（Papaveraceae）紫堇屬（Corydalis）植物延胡索（Corydalis yanhusuo W. T. Wang）的干燥塊莖，始載于《神農本草經》，具有活血散瘀、理氣止痛等功效，常用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛等治療［3］。研究發現延胡索具有良好的鎮痛、抗心律失常及改善冠心病等作用［4］。關于延胡索的化學成分研究始于上世紀20年代，延胡索丁素（Tetrahydrocoptisine，THC）作為其重要組成成分，具有良好的抗炎作用［5］。然而延胡索中THC對于AMI是否同樣具有良好的作用尚不清晰，因此本課題擬建立AMI大鼠模型，通過現代生物醫學技術深入考察延胡索丁素改善AMI的作用及機制，為延胡索的臨床應用奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡SD健康雄性大鼠50只，體重平均（220±20）g，清潔級，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠飼養于層流架中，12h晝夜交替，自由進食飲水，保持恒溫。適應性喂養1周后開展相關實驗。

1.2 主要試劑及儀器 延胡索丁素（HPLC≥98%，HT033199），寶雞市辰光生物科技有限公司；阿司匹林（HPLC≥98%，37655），美國 Aladdin公司；cTnI、CK-MB、Myo相關ELISA試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），南京建成生物工程研究所；蛋白提取試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；NLPR3、ASC及Caspase-1抗體，美國CST公司；ECL顯影試劑盒，美國GE公司；SDS-PAGE試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。小動物呼吸機，上海奧爾科特生物科技有限公司；高分辨小動物超聲影像系統，加拿大Visual sonics Inc公司；垂直電泳儀、半干轉膜儀，美國Bio-Rad公司；凝膠圖像分析系統，美國GE公司；MK3型酶標儀，美國Thermo公司。

1.3 模型建立 選擇40只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）進行麻醉，將其固定于手術臺并氣管插管進行機械通氣。消毒手術區域，打開胸腔暴露心臟，在左心耳及右心室流出道間對冠脈左前降支（LAD）進行結扎。當結扎線以下心肌組織泛白發紺，同時心電圖檢查有≥2個導聯J點抬高＞0.2mm時，表明模型建立成功。將心臟送回胸腔，擠壓排除空氣，縫合胸骨、肌層與皮膚。

1.4 分組與給藥 將模型大鼠隨機分為模型組、THC低劑量組（10mg/kg）、THC高劑量組（30mg/kg）、陽性對照組（阿司匹林，30mg/kg）。另取10只已進行手術但并未結扎的健康大鼠作為假手術組。各給藥組灌胃相應藥物28d，假手術組給予等量生理鹽水。

1.5 超聲心動圖檢測 給藥結束，大鼠腹腔麻醉后備皮并固定于手術臺，用小動物超聲儀在17.5MHz對其檢測。主要檢測內容包括：左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）及左心室射血分數（LVEF），取其中連續6個心動周期的平均值。

1.6 ELISA法檢測 大鼠采用眼眶采血，靜置30min后低溫離心（3500 r/min）5min，分離上層血清并與-20℃保存。根據試劑盒說明書檢測血清中肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）與肌紅蛋白（Myo）含量。

1.7 形態學考察 將大鼠脫頸椎處死，取其心臟。將部分心臟進行切片（2mm），置入-20℃冷凍后，在20%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中避光孵育15min。隨后進行形態學考察，心臟梗死部位為灰白色，正常組織為紅色。采用Image J軟件計算梗死面積比例=梗死面積/（梗死面積+非梗死面積）×100%。隨后，從10%甲醛溶液中取出心臟組織，經石蠟包埋、切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片，在光鏡下對心臟組織進行考察。

1.8 Western bloting檢測 取心臟組織溶于裂解緩沖液中，根據BCA試劑盒說明書對蛋白濃度進行測定。經上樣緩沖液孵育后，各組取等量蛋白使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉移至聚偏二氟乙烯膜。經5%BSA封閉后加一抗（NLPR3、ASC及caspase-1，1∶1000）在-4℃冰箱孵育過夜。次日在常溫條件下滴加二抗孵育30min，化學發光蛋白檢測試劑盒顯影成像。使用Image J軟件對各組蛋白表達進行半定量，β-Tubulin作為內參。

1.9 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟超聲結果比較 見表1。

表1 各組大鼠超聲結果的比較（）

表1 各組大鼠超聲結果的比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n LVEF（%） LVEDV（μl） LVESV（μl）假手術組 10 75.07±4.01 382.52±23.42 95.98±21.62模型組 10 61.49±5.0* 436.98±19.66* 167.61±14.39#THC低劑量組 10 67.46±2.76 429.28±36.67 139.96±19.29 THC高劑量組 10 71.96±3.97▲ 384.92±19.90▲ 107.40±9.99△陽性對照組 10 73.34±5.45▲ 382.21±19.96▲ 101.16±15.81△

2.2 各組大鼠心臟指數及梗死比例的比較 見表2。

表2 各組大鼠心臟指數及梗死比例的比較［%，（）］

表2 各組大鼠心臟指數及梗死比例的比較［%，（）］

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 n 心臟指數 梗死比例假手術組 10 0.29±0.05 0.0±0.0模型組 10 0.46±0.05* 35.31±3.47*黃柏堿低劑量組 10 0.44±0.04 28.2±1.24#黃柏堿高劑量組 10 0.34±0.03# 19.1±0.90▲氨芐青霉素鈉組 10 0.33±0.03# 20.76±1.45▲

2.3 各組大鼠體內心肌損傷標志物含量比較 見表3。

表3 各組大鼠血清中心肌損傷標志物含量的比較［μg/L，（）］

表3 各組大鼠血清中心肌損傷標志物含量的比較［μg/L，（）］

注：與假手術組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n CK-MB cTnl Myo假手術組 10 5.3±0.97 0.13±0.02 39.46±4.24模型組 10 65.17±7.72# 9.88±0.44# 51.90±4.55*THC低劑量組 10 42.11±4.58▲ 5.66±0.45△ 44.97±3.51 THC高劑量組 10 26.09±4.09△ 4.74±0.37△ 40.53±4.61▲陽性對照組 10 23.04±2.61△ 4.71±0.37△ 41.97±3.51▲

2.4 各組大鼠心臟病理學改變的比較 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌纖維呈粉紅色、層次明顯、分布均勻，無心肌纖維化，未見心肌間質炎癥細胞浸潤及梗死病灶等。模型組大鼠心肌組織梗死嚴重，病灶邊緣心肌纖維排列紊亂、斷裂，可見大量瘢痕及炎性細胞浸潤、炎癥性充血等。THC低劑量組大鼠心肌細胞排列不清，細胞邊界模糊，可見部分炎性細胞浸潤及局部壞死等現象。THC高劑量組與陽性對照組大鼠心肌細胞排列整齊，邊界清楚，少量炎癥細胞浸潤，無明顯壞死現象，細胞間質可見輕度水腫。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色

2.5 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達比較 見表4、圖2。

表4 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達水平的變化（）

表4 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達水平的變化（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n NLPR3/β-Tubulin ASC/β-Tubulin Caspase1/β-Tubulin假手術組 10 1.0±0.06 1.0±0.10 1.0±0.11模型組 10 2.34±0.08* 2.55±0.25# 1.89±0.17#THC低劑量組 10 1.96±0.13▲ 1.90±0.09▲ 1.47±0.20▲THC高劑量組 10 1.91±0.21▲ 1.24±0.09△ 1.19±0.16△陽性對照組 10 1.75±0.14bb 1.51±0.24△ 1.27±0.16△

圖2 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達水平的變化

2.6 各組大鼠血清中IL-1β及IL-18含量的比較 見表5。

表5 各組大鼠腎血清IL-1β及IL-18含量的變化［pg/ml，（）］

表5 各組大鼠腎血清IL-1β及IL-18含量的變化［pg/ml，（）］

注：與假手術組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n IL-1β IL-18假手術組 10 17.31±3.16 22.63±2.36模型組 10 55.34±6.56* 74.13±7.29#THC低劑量組 10 42.16±4.59▲ 59.21±2.60▲THC高劑量組 10 27.34±4.29△ 34.37±5.25△陽性對照組 10 30.37±2.44△ 31.58±3.57△

3 討論

急性心肌梗死是臨床常見危急重癥，其發病因素主要為冠狀動脈粥樣硬化狹窄，吸煙、飲酒、情緒激動、過度勞累等，繼而導致心力衰竭、心功能不全及心律失常。該病通常嚴重影響患者身心健康，大幅降低患者生活質量，是心血管疾病患者致死的關鍵誘因。中醫認為，AMI屬“真心痛”、“厥心痛”及“胸痹”等范疇，其主要病機為痰濁、瘀血阻于心脈，閉塞不痛、營氣不行等，主要治法以破瘀行氣及通絡止痛。延胡索具有活血散瘀、理氣止痛等功效，在AMI治療方面具有獨特療效。延胡索丁素是延胡索中重要成分，本研究通過建立AMI模型大鼠并給予延胡索丁素進行干預，通過心臟超聲及心肌梗死面積繼而初步評價延胡索丁素的對大鼠AMI的影響。結果顯示，延胡索丁素可有效改善心臟心功能指標，如：LVEF、LVEDV及LVESV，同時亦可縮小心肌梗死面積、降低心臟指數。由此提示，延胡索丁素具有緩解心肌梗死、逆轉心臟重塑及改善心功能不全等功效，具有重要的開發潛質，因此后續實驗開展了進一步的機制研究。

研究發現，AMI的治療時間與治療效果之間存在正相關性［6］，通常在AMI患者搶救治療中，務必采用早診斷、早治療原則，從而控制癥狀防范患者猝死及相關并發癥的發生。傳統AMI診斷主要通過對患者的心電圖及其臨床癥狀進行分析，由于該方式特異性差，易出現漏診或誤診等情況，因此臨床上開始對患者體內的心肌損傷標志物進行檢測。cTnI、CK-MB及Myo作為特征性血清學標志物，在AMI診斷中具有重要的參考意義。cTnI是人體心肌細胞的一種調節蛋白，在健康人體血清中含量較低，當心肌受損時釋放入血，具有較高的特異性及窗口期，其血清含量可直接表明AMI受損程度，因此被譽為心肌損傷的“金標準”，可作為心肌梗死的早期標志物。CK-MB是AMI的典型標志物，可特異性反映心肌損傷程度及治療溶栓效果。Myo廣泛分布于心肌及橫紋肌，當AMI發生時可最早檢測出，Myo同時也是AMI溶栓成功再灌注的考察標志物［7-8］。通過上述三項指標檢測，可有效判斷AMI的嚴重程度及相應治療效果。通過形態學考察發現，延胡索丁素可保護、修復心肌細胞、減輕AMI后的心臟損傷，同時通過檢測血清生化指標驗證了延胡索丁素具有良好的改善心肌損傷作用。

炎癥反應介導了AMI發生后的心肌損傷與修復的過程，通過緩解炎癥反應可有效改善心肌梗死癥狀，降低梗死面積。本研究結果顯示，延胡索丁素可有效降低心臟組織中NLPR3、ASC及Caspase-1的表達水平，同時抑制其下游IL-1β、IL-18的合成與釋放。提示延胡索丁素可通過介導NLPR3/Caspase-1信號通路，減少炎癥因子的釋放，緩解AMI后心肌細胞的炎癥性損傷。