SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信號通路在COPD患者Ⅱ型肺泡上皮細胞衰老中的作用研究

顧超 肖琴鋒 應櫻 陶峰 張齊 曹林峰

肺泡結構的破壞、肺組織降解以及氣腔的擴大是導致慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）中氣流受限重要原因［1］。目前為止，尚無足夠有效的藥物能夠阻止COPD患者肺功能的下降［2］。修復已經損傷的肺組織，并且使丟失的肺泡組織再生是目前COPD治療的關鍵及難點問題。Ⅱ型肺泡上皮細胞（AECⅡ）可以補充自身數量，也可分化為AECI，并合成以及分泌肺泡的表面活性物質，以及進一步維持肺泡內外液體的平衡等［3］。Sirtuins是Ⅲ型組蛋白的去乙酰化酶，可以對多種非組蛋白進行去乙酰化，并且在基因轉錄、能量代謝和細胞衰老中起重要作用［4］。本研究通過SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信號通路檢測其在COPD患者AECⅡ衰老中的相關作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 （1）患者入組：2017年1月至2018年12月在本院行手術治療的非小細胞肺癌且不伴COPD患者（A組）及COPD伴非小細胞肺癌（NSCLC）患者（B組）各20例。COPD伴NSCLC患者入選標準：符合COPD診斷標準，且第一秒用力呼氣量占所有呼氣量比值（FEV1/FVC）＜70%，50%≤一秒用力呼氣容積（FEV1）＜80%的預計值；符合NSCLC診斷標準，TNM分期為Ⅰa-Ⅱb期；擬行肺癌手術治療；2周內無COPD急性加重史；無支氣管哮喘。NSCLC且不伴COPD患者入選標準：符合國際肺癌研究協會（IASLC）2009年NSCLC診斷標準，TNM分期為Ia-IIb期；無COPD、支氣管哮喘等慢性氣道疾病；擬行肺癌手術治療。排除標準：存在除NSCLC以外其他惡性腫瘤史者；存在心、肝、腦等重要臟器功能不全的患者；有血液系統的相關疾病或者嚴重的凝血功能障礙患者；使用全身糖皮質激素者；使用化療藥物治療者。所取標本選自距肺癌病灶手術切除邊緣陰性5cm以外的肺組織，大小約1cm3，于-80℃保存。本項目由嘉興市第一醫院倫理委員會批準，所有患者均簽定知情同意書。（2）主要試劑：兔抗人的FoxO3a抗體（購于美國的Cell Signaling Technology公司）；細胞衰老的β-半乳糖苷酶染色盒及兔抗人p53抗體（購于江蘇碧云天公司）；TRIzol（購于美國的Invitrogen公司）；兔抗人SIRT1、SPA及SPC抗體及羊抗兔的IgG二抗（購自美國的Santa Cruz公司）；SIRT1去乙酰化酶檢測試劑盒（美國Enzo Life Sciences公司）。

1.2 方法 （1）肺組織的病理學測定：兩組患者的肺組織，于4%的甲醛中固定，脫蠟至水，后行HE染色，并按照本課題組前期的方法［5］，分析平均肺泡面積（MAA）和肺泡的平均內襯間隔（MLI）。（2）采用 Real-time PCR測 定 SIRT1、p53及 FoxO3a mRNA水平：收集兩組患者肺組織，GAPDH作為內參；并以2-ΔΔCt來分析目的基因的相對表達差異。引物序列：SIRT1正義鏈5'-GCAGATTAGTAGGCGGCTTG-3'，反 義 鏈 5'-ACTTTCATCCTCCATGGGTTC-3'；p53正義 鏈5'-ACCACCATCCACTACAACTACAT-3'， 反 義鏈 5'-CAGGACAGGCACAAACACG-3'；FoxO3a正義 鏈5'-TGGCAAGCACAGAGTTGGATGA-3'， 反 義鏈 5'-TGGCGGGAGCGTGATGTTAT-3'。GAPDH 正義鏈5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'，反義鏈5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。（3） 采 用Western blot檢測SIRT1、p53及FoxO3a的蛋白表達：取新鮮的肺組織100g來用于提取總蛋白，取含有20μg蛋白的樣品變性上樣，后行電泳、轉膜后予封閉，加入兔抗人SIRT1、p53及FoxO3a抗體孵育，之后加入山羊抗兔IgG孵育，凝膠成像系統掃描。（4）免疫組化法測定SPA及SPC蛋白的表達水平：肺組織切片，山羊血清予封閉，加入SPA或SPC抗體進行孵育，后加入抗兔IgG孵育，最后采用DAB顯色以及蘇木素復染后封片。（5）SA-β-gal活性測定：采用染色法測定患者的肺組織SA-β-gal的活性，按照試劑盒說明操作。（6）SIRT1去乙酰化酶活性測定：采用比色法檢測兩組患者的肺組織SIRT1去乙酰化酶活性，按照試劑盒說明操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織的病理學變化 兩組患者肺組織HE染色，B組患者的肺組織中呈現肺氣腫的表現：包括部分肺泡囊狀的擴張，并且肺泡腔不規則，以及相同視野內的肺泡數目減少，肺泡間隔出現斷裂，相鄰肺泡融合，見圖1。半定量分析顯示，B組患者的肺組織中的MAA和MLI明顯高于A組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者肺組織MLI及MAA變化（，n=20）

表1 兩組患者肺組織MLI及MAA變化（，n=20）

注：與A組比較，*P＜0.05

組別 MLI（μm） MAA（μm2）A組 38.43±3.14 3212.68±126.36 B組 190.12±15.22* 21008.14±771.63*

圖1 兩組患者肺組織病理學變化（HE染色，×100）

2.2 SIRT1、p53及FoxO3a表達水平 Real-time PCR及 Western blot分 別 測 定 SIRT1、p53及 FoxO3a的mRNA及蛋白表達水平，結果顯示，與A組比較，B組患者肺組織中SIRI1及FoxO3a的mRNA及蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而p53的mRNA及蛋白表達增加（P＜0.05），見圖 2、3。

圖2 兩組患者肺組織SIRT1、p53及FoxO3a mRNA相對表達變化

圖3 兩組患者肺組織SIRT1、p53及FoxO3a 蛋白表達變化

2.3 SPA和SPC蛋白的表達水平 SPA及SPC蛋白陽性細胞呈現胞漿著黃棕色，位于肺泡角部的AECⅡ，與A組比較，B組患者肺組織中SPA及SPC陽性細胞明顯減少，見圖4、5。

2.4 SA-β-gal的活性變化 在肺組織中被染色成藍色的細胞被認為是SA-β-gal陽性，即為衰老的細胞，主要位于肺組織肺泡的角部。與A組比較，B組患者中SA-β-gal陽性的細胞增加，見圖6。

圖4 兩組患者肺組織SPA蛋白表達（×400）注：黑色箭頭示SPA陽性細胞

圖5 兩組患者肺組織SPC蛋白表達（×400）注：黑色箭頭示SPC陽性細胞

圖6 兩組患者肺組織SA-β-gal活性變化（×400）注：黑色箭頭示SA-β-gal陽性細胞

2.5 SIRT1去乙酰化酶活性改變 采用比色法測定兩組患者肺組織中SIRT1去乙酰化酶的活性，結果顯示，與A組比較，B組患者肺組織中SIRT1去乙酰化酶活性明顯降低（P＜0.05），見圖 7。

圖7 兩組患者肺組織SIRT1去乙酰化酶活性比較（注：與A組比較，★P＜0．05）

3 討論

目前為止，COPD被認為是全球死亡原因的第 4 位［2，6］，在我國 ＞40 歲患病率達到 8.2%［7］。肺泡結構的破壞及丟失和氣腔擴大、肺彈性組織降解以及小氣道阻塞是COPD特征的病理表現，并且也是肺功能下降關鍵性原因［2］。本研究中，COPD患者肺組織中的部分肺泡囊狀擴張，肺泡腔的不規則，相同視野里的肺泡數目減少，肺泡間隔出現斷裂，相鄰的肺泡融合，符合COPD肺組織病理學表現。AECⅡ覆蓋肺泡總面積的5%，雖然AECI數量是AECⅡ的一半，但覆蓋了肺泡總面積95%。AECⅡ也能合成并分泌肺泡的表面活性等物質。AECⅡ對于維持肺泡正常結構及功能具有重要的意義。SPA及SPC是由AECⅡ特異性地分泌，其在減小肺泡表面的張力中起到重要的作用。AECⅡ是AECI的祖細胞，當AECⅡ嚴重受損時會導致肺泡結構受損和阻礙肺泡的修復［8-9］。在本研究中，COPD患者肺組織中的SPA以及SPC蛋白表達的水平明顯降低，表明肺組織中AECⅡ存在受損情況。

相關研究顯示：在COPD患者中的細胞衰老加速，進一步促進COPD的發生和發展［10］。因此，肺泡上皮細胞的異常表達可能與其過早衰老有關，AECⅡ衰老可能促進COPD發展，而深入研究AECⅡ衰老的調控機制可能為COPD治療提供新靶點。SIRT1目前被認為是人類的長壽相關基因。SIRT1可以將H1、H3的組蛋白進行去乙酰化，還能將p53和叉頭框蛋白O等非組蛋白去乙酰化，并在細胞衰老、基因轉錄及能量代謝中具有重要的作用［4］。吸煙人群外周肺組織中的細胞核SIRT1水平明顯降低；并且SIRT1表達下調可以促進COPD患者內皮祖細胞出現衰老以及功能異常［11］。p53是最早發現的SIRT1非組蛋白底物，其可激活靶基因p21轉錄，將細胞周期阻滯在G1/S期，進而抑制細胞增殖以及進一步促進細胞衰老［12］。SIRT1則可使p53特異位點賴氨酸殘基去乙酰化或作用于p53靶基因啟動子，抑制p53活性、延緩細胞衰老。FoxO3a是insulin、IGF等信號通路關鍵性下游調節靶點；在insulin或IGF刺激下，FoxO3a發生磷酸化，SIRT1與其形成蛋白復合物，使其去乙酰化、轉位出核，抑制p27等基因表達、促進細胞存活［13-14］。COPD患者氣道組織中核內FoxO3a的表達亦與其細胞衰老水平一致［15］。SA-β-gal是細胞衰老的重要相關標記［16］。在本研究中，B組患者肺組織中SIRI1及FoxO3a mRNA及蛋白表達明顯低于A組，而p53 mRNA及蛋白表達高于A組；并且肺組織中的SA-β-gal陽性的細胞顯著增加，SIRT1去乙酰化酶活性明顯降低。

綜上所述，SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信號通路通過下調SIRT1和FoxO3a的表達及上調p53的表達來調控COPD患者Ⅱ型肺泡上皮細胞的衰老。但是，FoxO3a與p53信號通路之間的交匯對話機制仍需進一步研究。