紅細胞溶血試驗用于評價淋洗類化妝品眼刺激性的初步研究

田妮娜，劉興國，李 巖，王月玲

（蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050）

兔眼刺激性試驗（Draize 試驗）是指動物眼球接觸到化學物質產生炎癥反應的過程，是目前評估眼刺激性的金標準[1-2]，通過實驗人員肉眼觀察血紅蛋白的漏出和變性進行評分，方法周期長、成本高，存在一定的主觀性和差異性；同時,隨著動物保護運動的興起和人們對“3R”運動的關注[3],體外替代試驗的研究已廣泛開展[4-7]。

紅細胞溶血試驗（RBC）的基本原理是化學物質損傷細胞膜，改變其滲透性，引起血紅蛋白的漏出和變性，進而導致溶血發生[8]。含表面活性劑的產品主要通過破壞眼部脂質和蛋白結構導致損傷，這和紅細胞溶血試驗的基本原理類似[9]。故本研究收集易觸及眼睛的4類淋洗類化妝品（洗發、護發、沐浴和潔面），參照《化妝品衛生規范》(2007年版)規定的眼刺激試驗的要求，進行紅細胞溶血試驗和Draize試驗，并評價其相關性，以考察紅細胞溶血試驗用于評價淋洗類化妝品眼刺激性的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品一部分來自蘭州市藥品檢驗所送檢的化妝品，其余部分市場購買，洗發、護發、沐浴和潔面4類各20批次，配方中均含有表面活性劑。

1.2 2%紅細胞懸液（牛、羊、豬、兔）

購自北京博爾西科技有限公司和岑溪鴻泉生物科技有限公司，100ml/瓶，2-8℃保存，3-4周內使用。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，NaCl8g，KCl 0.2g,溶于1000ml純化水中，pH 為7.4，121℃滅菌30min），十二烷基硫酸鈉（SDS）（1000mg/L）。

1.3 實驗動物

新西蘭大耳白兔，普通級，雌雄兼用，雌性未孕，購自蘭州畜牧獸醫研究所，并飼養在蘭州市食品藥品檢驗所藥理室普通級動物房。實驗動物合格證：SCXK（甘）2015-0001號。

1.4 主要儀器

艾本德紫外分光光度計，艾本德高速離心機，IKA振蕩培養箱。

1.5 實驗方法

1.5.1 紅細胞溶血試驗

先進行預試驗預測樣品的HD50范圍。樣品用PBS配制成濃度為10000mg/L（w/v）的貯備液，超聲振蕩使其完全溶解。取不同濃度的樣品溶液 （逐級稀釋貯備液至 1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）、PBS（空白對照）、純化水（全溶血對照）、SDS（陽性對照）各1.5mL，分別加入0.5mL羊紅細胞懸液，在32℃培養箱中振蕩孵育30min，13000r/min離心2min，取上清液，以PBS為空白對照，測定540nm、560nm、575nm波長下的吸光度(A)。

通過預試驗，預確定HD50的樣品濃度，為準確的測定HD50值，在預測值上下均勻布置5個濃度，用PBS配制成濃度為2倍預測值的樣品貯備液，然后按照表1設計的方案進行試驗。

表1 試驗方案

用雙復管測定，取平均值，以A560縱坐標，樣品濃度（mg/L）為橫坐標作線性回歸方程,計算HD50，血紅蛋白變性指數（DI）和HD50/DI，同時比較四種屬間實驗結果的差異。

1.5.2 家兔眼刺激試驗

按《化妝品衛生規范》（2007）對受試樣品進行眼刺激性分級[9]。

2 結果

2.1 試驗結果

80種化妝品體內試驗(兔眼刺激試驗)和四種紅細胞(牛/羊/豬/兔)溶血性試驗結果進行比較，見表2。

表2 80種化妝品體內試驗和四種紅細胞溶血性試驗結果比較

2.2 統計分析

應用SPSS進行數據分析。經Kruskal-Wallis檢驗,在α=0.05的水平下，每類產品的動物試驗和四種溶血試驗之間無顯著性差異 (P＞0.05)，但匯總80種化妝品后，P=0.01，存在一定差異，主要是兔紅細胞溶血實驗引起的差異。分析兔紅細胞溶血試驗的數據，發現其HD50值均高于牛、羊、豬紅細胞溶血試驗的，DI值沒明顯區別，故導致HD50/DI值略高，產生差異。經kappa一致性檢驗，得出動物試驗和兔紅細胞溶血試驗一致性一般，牛、羊、豬紅細胞溶血試驗一致性良好。

3 討論

1)對受試物與紅細胞懸液作用的體積比進行選擇，用不同體積比的純化水與綿羊紅細胞懸液混合，發現體積比為1∶3時，紅細胞發生全溶血。故選用體積比為 1∶3。

2)對測量波長進行選擇，采用不同濃度SDS，分別與羊紅細胞懸液作用，在540nm、560nm、575nm測定吸光度A，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制曲線，各波長在100mg/L處吸光度達到最高峰（即紅細胞發生蛋白變性），在560nm波長下最高峰后曲線接近直線，故選擇560nm為測量溶血波長；540nm和575nm波長下最高峰后曲線明顯下降，但在1000mg/L后，其曲線不再下降（即蛋白不在變性），故選擇1000mg/LSDS作為血紅蛋白變性的陽性對照。

3)對北京博爾西科技有限公司和岑溪鴻泉生物科技有限公司的紅細胞懸液進行比較研究，其制備方法、檢測報告參數、四種紅細胞懸液溶血試驗結果基本相同，故市售的成品紅細胞懸液可以直接用來開展溶血試驗，但一定注意保存條件，且在效期內使用。

4)本試驗中，牛、羊、豬紅細胞溶血試驗和Draize試驗之間無顯著性差異，研究表明，溶血試驗適用于含表面活性劑的產品，洗發、護發、沐浴和潔面4類淋洗類產品均含有表面活性劑，因此，可以作為淋洗類化妝品眼刺激試驗的一個初篩試驗。同時，本研究收集4類化妝品中所用到的表面活性劑，覆蓋陰離子、陽離子、兩性離子、非離子表面活性劑，刺激性涵蓋各個刺激反應分級，溶血試驗和體內試驗相關性良好，進一步證明紅細胞溶血試驗可用于評價淋洗類化妝品眼刺激性。

5)由于動物種屬間紅細胞膜結構存在一定差異，牛、羊、豬紅細胞溶血試驗與兔紅細胞溶血試驗相比，更適合于淋洗類化妝品眼刺激試驗的一個初篩試驗。試驗方法簡單快速，重復性良好,無需細胞培養，對于淋洗類化妝品眼刺激試驗具有較好的眼刺激性預測能力，是一種有潛力的替代方法。