HPVDNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測對宮頸癌的診斷價值

武麗蕊，王蘭朋，李紅霞，劉勃

1河北中石油中心醫院婦科，河北 廊坊065000

2廊坊市人民醫院胸外科，河北 廊坊065000

宮頸癌的發病率居女性全部惡性腫瘤的第1位，嚴重威脅女性的身體健康，宮頸癌的防治是臨床關注的熱點。研究顯示，宮頸癌患者多伴有人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，其發病與患者持續的HPV感染狀態有關。目前已經確定的HPV分型有100多種，其中40多種與宮頸感染有關[1-2]。HPV可分為高危型和低危型，多數臨床檢測發現，高危型HPV更容易引起宮頸癌，但是尚存在較大的爭議。HPV DNA分型檢測可以區分HPV分型，確定患者為哪類HPV感染，有助于進一步闡明HPV感染與宮頸癌的關系[1-3]。v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）可以調節細胞生長，與卵巢癌、肺癌的發生有關[4]。Ki-67是一類增殖細胞核抗原，與乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的增殖和預后不良有關[5]。本研究探討了HPV DNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測對宮頸癌的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年12月河北中石油中心醫院收治的宮頸癌患者作為觀察組。納入標準：①經病理檢查確診為宮頸癌；②已婚女性，有性生活；③神志清楚，溝通能力良好。排除標準：①合并其他部位腫瘤；②合并其他嚴重臟器疾病；②合并感染性疾病或免疫系統疾病。依據納入和排除標準，本研究共納入86例宮頸癌患者。另選擇同期體檢的90例宮頸炎患者為對照組。觀察組患者的年齡為35～67歲，平均（43.25±7.46）歲。對照組患者的年齡為36～65歲，平均（42.7±7.32）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 HPV DNA分型檢測

兩組患者均于月經干凈后3～7天進行檢測，采樣前3天避免性生活、陰道沖洗及陰道用藥等。使用無菌宮頸刷采集患者宮頸口分泌物，然后將宮頸刷折斷置于細胞保存液中，4℃保存。采用微生物DNA提取試劑盒提取宮頸分泌物DNA，嚴格按照操作步驟進行。使用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-反向點雜交方法，采用HPV基因分型試劑盒檢測HPV，包括15種高危型HPV和6種低危型HPV。

1.3 免疫組織化學染色方法

采用免疫組織化學染色方法檢測KRAS和Ki-67的表達情況，具體步驟如下：病灶組織切除后，使用無菌生理鹽水沖洗組織上面的血液、黏液等，立即使用4%多聚甲醛固定；固定24 h后將組織取出，逐步進行石蠟包埋、切片等；將石蠟切片進行二甲苯、梯度乙醇水化；流水沖洗后，將組織切片浸沒于檸檬酸鈉抗原修復液中，37℃條件下在微波爐內加熱6 min，共4次，修復切片抗原，每加熱6 min檢查液面，避免干片現象發生；將切片置于室溫下自然冷卻，然后使用流水沖洗抗原修復液，再使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗；應用內源性生物素封閉切片中的內源性過氧化物酶；PBS清洗后，使用山羊血清封閉10 min，直接將KRAS和Ki-67一抗孵育在切片上，置于4℃冰箱中過夜；采用PBS沖洗切片上的一抗，室溫下孵育二抗60 min；PBS沖洗二抗，使用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，并在顯微鏡下觀察，待切片出現棕黃色后使用流水沖洗，終止反應；將切片置于蘇木精內復染3 min，流水沖洗，鹽酸乙醇分化，返藍后，將切片脫水；使用二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干[6]。

1.4 觀察指標及評價標準

比較兩組患者的HPV DNA陽性率，分析兩組患者的HPV DNA分型。分析KRAS、Ki-67、HPV DNA分型及三者聯合檢測診斷宮頸癌的靈敏度、特異度及準確度。KRAS、Ki-67陽性表達位于細胞質或細胞核，采用高倍顯微鏡觀察免疫組織化學染色結果。依據陽性細胞比例評分：0～10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分；依據染色程度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。陽性細胞比例評分與染色程度評分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中度陽性（++），＞4分為強陽性（+++）[5-6]。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料的比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV DNA陽性率的比較

觀察組患者的HPV DNA陽性率為97.67%（84/86），高于對照組的14.44%（13/90），差異有統計學意義（χ2=123.649，P＜0.05）。

2.2 兩組患者的HPV DNA分型

觀察組患者的HPV DNA分型以高危型病毒HPV16、HPV18為主，對照組患者的HPV DNA分型以低危型病毒HPV6、HPV11為主。（表1）

表1 兩組患者的HPV DNA分型[ n（%）]*

2.3 KRAS和Ki-67表達情況的比較

兩組患者的KRAS和Ki-67表達情況比較，差異均有統計學意義（u=3.837、8.239，P＜0.05）；其中觀察組患者的KRAS和Ki-67陽性率均為100%，分別高于對照組的35.56%（32/90）和16.67%（15/90），差異均有統計學意義（χ2=5.396、4.241，P＜0.05）。（表2）

表2 兩組患者的KRAS和Ki-67表達情況

2.4 HPV DNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測對宮頸癌的診斷價值

HPV DNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測診斷宮頸癌的特異度和準確度均高于任一單獨檢測方法。（表 3）

表3 不同檢測方法對宮頸癌的診斷價值

3 討論

近年來，宮頸癌的發病呈年輕化趨勢，早期發現并進行治療能夠明顯降低患者的死亡率，對改善患者預后具有重要意義。研究顯示，宮頸癌的發病與長期持續感染HPV有關，特別是高危型HPV患者發生宮頸癌的可能性更大，因此，發生高危型HPV感染的患者應增加宮頸病變檢查次數，注意宮頸病變的發生狀況[7-9]。HPV DNA分型檢測能夠明確患者感染HPV的類型，了解哪種HPV感染容易引起宮頸癌，進而重點預防，為宮頸癌的早期發現提供依據[10-11]。KRAS基因是Ras家族成員，位于12號染色體上，具有編碼KRAS蛋白的功能，能夠調控細胞的生長，而當人體發生病變時，它能夠促進細胞持續生長，甚至導致基因突變，進一步引起細胞內信號轉導異常，致使細胞持續增殖發生癌變[11-12]。Ki-67是細胞增殖的重要標志物，在細胞分裂的不同時期均有表達，與腫瘤的發生、轉移有關[13-14]。

本研究對86例宮頸癌患者和90例宮頸炎患者進行了HPV DNA分型及KRAS、Ki-67檢測，結果顯示，宮頸癌患者的HPV陽性率高于宮頸炎患者，提示HPV感染與宮頸癌的發生具有密切關系，與以往文獻報道結果一致[7,15]，充分顯示了HPV感染是患者發生宮頸癌的危險因素。本研究結果顯示，宮頸癌患者感染HPV以HPV16和HPV18等高危型為主，而宮頸炎患者感染HPV以HPV6和HPV11等低危型為主，提示高危型HPV16、HPV18感染的患者更易發生宮頸癌。本研究表明，宮頸癌患者的KRAS、Ki-67陽性率均高于宮頸炎患者，提示宮頸癌患者由于發生病變導致KRAS、Ki-67表達水平升高，這兩個指標可作為宮頸癌輔助診斷的工具[16-19]。本研究結果還顯示，HPV DNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測診斷宮頸癌的特異度和準確度均高于任一單獨檢測方法，進一步說明這些指標可為早期預防宮頸癌提供可靠的依據。然而本研究由于病例選擇有限、研究時間短等因素，未對宮頸癌及宮頸炎患者進行分級，下一步將會更加深入詳細地探討宮頸癌的發生及發展機制，為臨床治療提供更多依據。

綜上所述，宮頸癌患者的HPV陽性率及KRAS、Ki-67陽性率均較高，宮頸癌患者感染HPV以高危型HPV16和HPV18為主，且HPV DNA分型聯合KRAS、Ki-67檢測對宮頸癌的診斷效能較高。