腦缺血后不同時間段血管內(nèi)皮生長因子表達和微血管形成的關(guān)系

李成建

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院ICU 河南鄭州450007）

缺血腦卒中是我國乃至世界范圍內(nèi)較為普遍的致死性疾病，大部分腦卒中患者均存在不同程度、不同方面的功能障礙。近年來，有關(guān)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在缺血性腦卒中治療中的作用已得到廣泛研究，但大多數(shù)研究通過大鼠腦組織切片獲得微血管密度數(shù)據(jù)，缺乏連續(xù)觀察，對于微血管密度與VEGF 之間的時間效度關(guān)系沒有十分明確的數(shù)據(jù)說明[1～2]。隨著激光散斑成像（LSI）、激光掃描共聚焦（LSC）技術(shù)的出現(xiàn)，研究者可以更加容易獲取不同時間點大腦中動脈血供情況，同時還可以通過抽取腦脊液檢測VEGF 濃度[3]。本研究通過Longa 線栓法建立左大腦中動脈缺血MCAO 模型，觀察微血管密度與腦脊液VEGF 濃度之間的關(guān)系。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物模型制備、 檢測方法與觀察指標 選取40 只成年雄性SD 大鼠（上海市斯萊克動物實驗有限責(zé)任公司提供），標準環(huán)境飼養(yǎng)，Longa 線栓法建立左大腦中動脈缺血MCAO 模型。分別于術(shù)后1 h、3 d、7 d、28 d 分4 次，每次10 只，采用LSI 技術(shù)檢測血流，LSC 技術(shù)檢測微血管密度，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠腦脊液VEGF 濃度。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料用（）表示，計數(shù)資料用%表示，采用方差分析、多元線性回歸相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦中動脈血供、 微血管密度、 腦脊液VEGF 濃度隨時間變化情況 重復(fù)測量方差分析顯示，Longa 線栓法術(shù)后大鼠大腦中動脈血供缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=12.422 3，P＜0.01），缺血后7 d 比缺血后3 d 增加（F=8.470 3，P＜0.01），缺血后28 d 比缺血后7 d 增加（F=10.195 5，P＜0.01）；微血管密度缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=2.434 2，P=0.012 2），缺血后7 d 比缺血后3 d 增加（F=3.466 4，P=0.0023），缺血后28d 比缺血后7 d 增加（F=1.122 5，P=0.040 1）；腦脊液VEGF 濃度缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=30.110 7，P＜0.01），缺血后7 d 比缺血后3 d 降低（F=3.288 9，P=0.001 8），缺血后28 d 比缺血后7 d 降低（F=4.120 0，P=0.037 1）。見表1。大鼠大腦中動脈血供及微血管密度隨時間增加而持續(xù)增加，而腦脊液VEGF 濃度在第3 天達到高峰后即開始下降。見圖1。

表1 大鼠大腦中動脈血供、微血管密度、腦脊液VEGF 濃度變化情況

表1 大鼠大腦中動脈血供、微血管密度、腦脊液VEGF 濃度變化情況

指標 缺血后1 h 缺血后3 d 缺血后7 d 缺血后28 d中動脈供血（%）微血管密度（%）腦脊液VEGF濃度（pg/ml）38.53±2.41 1.17±0.63 0.65±0.15 62.84±3.32 2.10±0.70 4.56±0.34 77.09±3.98 5.56±0.62 4.09±0.89 92.01±3.02 5.98±1.21 2.10±0.52

圖1 大鼠大腦中動脈血供、微血管密度、腦脊液VEGF 濃度隨時間變化情況

2.2 大鼠缺血后微血管密度與VEGF 濃度的相關(guān)性分析 多元線性回歸分析顯示，微血管密度=0.023+1.724×?xí)r間-0.096×VEGF 濃度，提示大鼠缺血后微血管密度與術(shù)后時間、VEGF 濃度存在線性關(guān)系（F=524.681，P=0.000）。見圖2。

圖2 大鼠缺血后微血管密度與VEGF 濃度的相關(guān)性

3 討論

動物實驗[3]證實，VEGF 對缺血性疾病有明顯的治療意義，但外源性VEGF 難以透過血腦屏障，且進入循環(huán)系統(tǒng)后半衰期過短，實際治療價值十分有限。在動物實驗中，直接將外源性VEGF 輸入大鼠腦室，可以明確觀察到缺血區(qū)血管內(nèi)皮細胞增殖形成血管[4]。雖然VEGF 增加毛細血管通透性作用是組胺的5 萬倍，有致腦組織腫脹、腦疝形成等風(fēng)險，但是VEGF 同時對神經(jīng)前體細胞的增殖具有明顯調(diào)控作用，與神經(jīng)發(fā)生有關(guān)，具備神經(jīng)營養(yǎng)與神經(jīng)保護作用[5]。因此，在嚴格控制VEGF 劑量效應(yīng)關(guān)系的情況下，可以最大發(fā)揮VEGF 減小腦梗死體積的作用而減少腦水腫效應(yīng)。

既往研究[6]顯示，腦組織缺血后VEGF 家族不同時間表達情況有所差異，但都能直接促進血管內(nèi)皮細胞快速增殖并新生血管形成。也有研究[7～8]發(fā)現(xiàn)，在腦組織缺血48 h 后即出現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞增殖微血管發(fā)生，且VEGF 表達也會在缺血后1 d 開始。但是這些研究獲取的VEGF 表達情況以及大鼠微血管密度數(shù)據(jù)均是來自于不同個體，設(shè)計存在缺陷。本研究采用LSI 采集大鼠大腦中動脈血流數(shù)據(jù)，LSC 技術(shù)采集微血管形成數(shù)據(jù)，未處死大鼠，可以連續(xù)觀察大鼠腦缺血阻斷后血供以及微血管形成情況。在Longa 線栓法術(shù)人工干預(yù)造成大鼠腦缺血后1 h、3 d、7 d 和28 d，分別測得大腦中動脈血供、微血管密度以及腦脊液VEGF 濃度。雖然本實驗過程中有4 只大鼠發(fā)生死亡，但是得到一組同一個體不同時間點連續(xù)觀察的實驗數(shù)據(jù)。重復(fù)測量資料的方差分析顯示，大鼠腦缺血后1 h、3 d、7 d、28 d 這4 個時間點大腦中動脈血供、微血管密度、腦脊液VEGF濃度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。腦脊液中VEGF 濃度高峰出現(xiàn)在缺血后1 h 到缺血后7 d 之間，缺血后3 d 測得濃度為（4.56±0.34）pg/ml，由于實驗設(shè)計時未防止過于頻繁暴露大鼠皮下傷口，選擇時間上偏重于1 h、3 d、7 d、28 d，腦脊液VEGF 濃度峰值更為準確的出現(xiàn)時間暫不得而知，需要下一步實驗縮短檢測時間差。但是在本研究中，微血管密度是持續(xù)升高的，期間沒有微血管密度高峰表現(xiàn)，與既往研究[9]結(jié)果基本一致。回歸分析亦表明大鼠缺血后微血管密度與術(shù)后時間、VEGF 濃度存在線性關(guān)系（F=524.681，P=0.000）。由于將術(shù)后時間作為有序變量賦值納入方程，得到的微血管密度與VEGF 負相關(guān)結(jié)果與一般認識有所出入，需要下一步實驗進一步優(yōu)化觀察。

綜上所述，腦組織缺血后VEGF 表達與微血管密度之間存在明顯相關(guān)性，VEGF 存在一個表達高峰，大概在缺血后1 h～7 d，位于缺血后3 d 左右，而微血管發(fā)生是一個持續(xù)發(fā)展過程。但是本研究實驗方法有一定局限性，在進行大鼠顱骨打磨時由于每只大鼠顱骨厚度差異，并不能保證大鼠顱骨厚度能夠完全一致，LSI、LSC 成像時會有一定偏差。而且每只大鼠測量數(shù)據(jù)之后沒有處死，而是進行傷口閉合，期間傷口情況可能對實驗數(shù)據(jù)造成一定影響。