復方麝香注射液聯合神經節苷脂對彌散性軸索損傷大鼠神經元凋亡的影響

宋國智 張學強 王霞 常成 陳建軍

摘要? 目的：探討復方麝香注射液聯合神經節苷脂對彌散性軸索損傷（DAI）大鼠神經元凋亡及神經絲蛋白200（NF200）、生長相關蛋白43（GAP-43）、凋亡相關蛋白激酶1（DAPK1）表達的影響。方法：采用大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置建立DAI大鼠模型。將成功建立的45只DAI大鼠隨機分為模型組、實驗組和聯合組，每組15只;另選擇15只正常大鼠作為對照組。實驗組大鼠腹腔注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉[30 mg/（kg·d）]，聯合組大鼠腹腔注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉[30 mg/（kg·d）]+復方麝香注射液[2 mL/（kg·d）]，對照組與模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續干預7 d。采用改良神經功能缺損評分（mNSS）法評估各組大鼠的神經功能缺損情況;采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠腦組織病理學變化;采用TdT介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）檢測各組大鼠神經元凋亡情況;采用蛋白質免疫印跡（Wb）法檢測大鼠腦組織NF200、GAP-43與DAPK1蛋白表達。結果：干預第1～7天，模型組、聯合組與實驗組大鼠mNSS評分均逐漸降低;與對照組比較，模型組大鼠第1～7天的mNSS評分均明顯升高，但聯合組與實驗組低于模型組，聯合組低于實驗組（ P <0.05）;與對照組比較，模型組大鼠神經元凋亡指數及腦組織DAPK1蛋白相對表達量均明顯升高，且聯合組與實驗組低于模型組，聯合組低于實驗組（ P <0.05）;NF200、GAP-43蛋白相對表達量明顯降低，且聯合組與實驗組高于模型組，聯合組高于實驗組（ P <0.05）。結論：復方麝香注射液聯合神經節苷脂治療DAI可改善大鼠神經功能缺損情況，抑制神經元凋亡，改善神經功能，其作用機制可能與上調腦組織NF200、GAP-43蛋白表達，下調DAPK1蛋白表達相關，且兩藥聯合使用效果更佳。

關鍵詞? 彌散性軸索損傷;單唾液酸四己糖神經節苷脂;復方麝香注射液;神經元;凋亡;神經絲蛋白200;生長相關蛋白43;凋亡相關蛋白激酶1

Effects of Compound Shexiang Injection Combined with Ganglioside on Neuronal Apoptosis in Rats with Diffuse Axonal Injury

SONG Guozhi1，ZHANG Xueqiang1，WANG Xia2，CHANG Cheng1，CHEN Jianjun1

（1 Handan Central Hospital，Handan 056001，China; 2 Handan First Hospital，Handan 056001，China）

Abstract Objective： To explore effects of Compound Shexiang Injection combined with ganglioside on neuronal apoptosis and expressions of neurofilament 200（NF200），growth-associated protein 43（GAP-43）and death-associated protein kinase 1（DAPK1）in rats with diffuse axonal injury（DAI）. Methods： DAI rat models were established using a rat skull transient rotation injury device.Forty-five DAI rats successfully established were randomly divided into model group，test group and combined group，with 15 rats in each group.Another 15 normal rats were selected as control group.Rats in the test group were intraperitoneally injected with monosialotetrahexosyl ganglioside sodium[30 mg/（kg·d）]，rats in the combined group were injected intraperitoneally with monosialotetrahexosyl ganglioside sodium（30 mg·kg-1·d-1）+Compound Shexiang Injection（2 mL·kg-1·d-1），and the model and control groups were injected intraperitoneally with the same amount of normal saline，for 7 d.Modified neurological severity score（mNSS）method was used to evaluate neurological deficits in each group of rats.Hematoxylin-eosin（HE）staining was used to observe pathological changes of brain tissue in rats.TdT-mediated dUTP Notch End Labeling（TUNEL）was used to detect neuronal apoptosis in each group of rats.Protein expressions of NF200，GAP-43 and DAPK1 in rat brain tissue were detected by Western blot（Wb）method. Results： From the 1st to 7th d of the intervention，the mNSS scores of rats in the model group，the combined group and the test group were gradually decreased.Compared with the control group，the mNSS scores of the rats in the model group were significantly increased from the 1st to 7th d，but those in the combined group and the test group were lower than those in the model group，and those in the combined group were lower than those in the test group（P < 0.05）.Compared with the control group，the neuronal apoptosis index and the relative expression of DAPK1 protein in brain tissue of rats in the model group were significantly increased，and those in the combined group and the test group were lower than those in the model group，and those in the combined group were lower than those in the test group（P < 0.05）.The relative expressions of NF200 and GAP-43 proteins were significantly decreased，and those in the combined group and the test group were higher than those in the model group，and those in the combined group were higher than those in the test group（P < 0.05）. Conclusion： Compound Shexiang Injection combined with ganglioside in the treatment of DAI can improve neurological deficits in rats，inhibit neuronal apoptosis，and improve neural function.Its mechanism of action may be related to up-regulation of NF200 and GAP-43 protein expressions in brain tissue and down-regulation of DAPK1 protein expression，and the combined use of the 2 drugs is more effective.

Keywords? Diffuse axonal injury; Monosialotetrahexosyl ganglioside; Compound Shexiang Injection; Neuron; Apoptosis; Neurofilament 200; Growth-associated protein 43; Death-associated protein kinase 1

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.015

彌散性軸索損傷（Diffuse Axonal Injury，DAI）是頭部受到外力作用后發生成角或旋轉加/減速運動所造成的一種原發性腦實質的損傷，以軸索損傷為主要改變，上腦干背外側象限局灶性出血、胼胝體局灶性出血和軸索的廣泛損害是其特征性病理改變，但由于目前其發病機制尚不明確，臨床尚無治療DAI的有效手段[1]。神經節苷脂是一種酸性鞘糖脂，是臨床較常用的神經營養藥物之一，可維持細胞膜結構和功能的完整性，但單獨使用修復受損神經細胞的作用有限[2]。中醫學理論認為，DAI屬血瘀癥范疇，頭部暴力傷后，腦絡損傷，導致血流不暢，氣血逆亂，故傷后昏迷時間長，治則以醒神開竅、活血化瘀為主[3]。復方麝香注射液是在安宮牛黃丸組方基礎上改制而成的水溶性注射液，具有行氣活血、清熱涼血及醒神止痙等功效，有擴張血管、抗驚厥、鎮靜與興奮中樞神經系統的作用，臨床多用于治療神經系統及腦血管疾病[4]。而目前復方麝香注射液聯合神經節苷脂治療DAI尚未見報道，因此開展本研究，以期能夠為其臨床推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量200～220 g，購于上海靈暢生物科技有限公司，動物生產合格證號為SCXK（滬）2018-0003。飼養環境與條件：上海靈暢生物科技有限公司屏障環境動物實驗室，每籠5只，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。

1.1.2 藥物 復方麝香注射液[神威藥業（四川）有限公司，生產批號：19030331];單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉（北京賽升藥業股份有限公司，生產批號：20180112）。

1.1.3 試劑與儀器 TdT介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）凋亡試劑盒（美國Promega公司，生產批號：200-664-3）;兔抗鼠神經絲蛋白200（NF200）抗體（英國Abcam公司，生產批號：1392503Z）;兔抗鼠生長相關蛋白43（GAP-43）抗體（美國Santa Cruz公司，生產批號：PB11058）;兔抗鼠凋亡相關蛋白激酶1（DAPK1）抗體（美國Sigma公司，生產批號：L750N46）;石蠟切片機（上海三崴醫療設備有限公司，型號：HM340E型）;高速冷凍離心機（美國Beckman公司，型號：Couvter型）;光學顯微鏡（德國LEICA公司，型號：DM LB2型）;多功能酶標儀（瑞士TECAN公司，型號：M200 PRO型）;分析軟件（美國Media Cybernetics公司，型號：Image-Pro Plus v6.0）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置建立DAI大鼠模型：按照2 mL/kg的劑量用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于旋轉損傷裝置，進行大鼠頭顱沿冠狀面側向旋轉90°的瞬間旋轉致傷，并快速制動靜止。將成功建立的45只DAI大鼠隨機分為模型組、實驗組及聯合組，每組15只，另選擇15只正常大鼠作為對照組[5]。

1.2.2 干預方法 實驗組大鼠腹腔注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉[30 mg/（kg·d）]，聯合組大鼠腹腔注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉[30 mg/（kg·d）]+復方麝香注射液[2 mL/（kg·d]，對照組與模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續干預7 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 改良神經功能缺損評分（mNSS）法[6]評估各組大鼠的神經功能缺損情況 各組大鼠于干預1、3、5、7 d采用mNSS法評估各組大鼠神經功能缺損情況，主要包括：運動、感覺、平衡木及反射4項測試，記分為0～18分，分數越高，表明腦損傷越嚴重。

1.2.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色[7]觀察大鼠腦組織病理學變化 干預第7天進行mNSS評分后，采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，解剖、采集大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，經脫水、包埋、切片（5 μm）等制作石蠟切片，行常規HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理學特點。

1.2.3.3 TUNEL法檢測大鼠神經元凋亡情況 取石蠟切片，按照TUNEL凋亡試劑盒說明書提供的步驟進行TUNEL染色[8]。于倒置熒光顯微鏡下觀察陽性細胞，即凋亡細胞，細胞核染為綠色為陽性細胞，每個標本隨機選擇5個視野，計算細胞凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.3.4 蛋白免疫印跡（Wb）法[9]檢測大鼠腦組織NF200、GAP-43與DAPK1蛋白表達 取-80 ℃保存的腦組織，加入裂解液勻漿，離心后取上清液，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕轉膜后封閉，加入1∶ 1 000稀釋的一抗NF200、GAP-43與DAPK1，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h。采用Image-Pro Plus v6.0分析軟件進行蛋白條帶的灰度值分析，以目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料以 （ ±s） 表示，組間比較采用 t 檢驗，以 P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較 干預第1～7天，模型組、聯合組與實驗組大鼠mNSS評分均逐漸降低;與對照組比較，模型組大鼠第1～7天的mNSS評分均明顯升高，但聯合組與實驗組低于模型組，聯合組低于實驗組（ P <0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠腦組織病理學變化 對照組大鼠腦組織結構完整，未見異常，神經元數量多，形態規則;模型組大鼠腦組織結構疏松，間質水腫，軸突出現斷裂變性，神經元數量明顯減少，細胞皺縮、核深染，且大部分神經元水腫并壞死;聯合組與實驗組大鼠腦組織病變明顯改善，神經元數量較模型組顯著增多，壞死程度減輕，神經元形態趨于正常，且聯合組大鼠腦組織病變改善程度優于實驗組。見圖1。

2.3 各組大鼠神經元凋亡情況 對照組、模型組、聯合組與實驗組大鼠神經元凋亡指數分別為 （8.64±3.21）%、（51.22±5.37）%、（16.84±4.22）%、（36.51±3.87）%。與對照組比較，模型組大鼠神經元的凋亡指數明顯升高，且聯合組與實驗組低于模型組，聯合組低于實驗組（ P <0.05）。見圖2。

2.4 各組大鼠腦組織NF200、GAP-43與DAPK1蛋白表達 與對照組比較，模型組大鼠腦組織NF200、GAP-43蛋白相對表達量明顯降低，且聯合組與實驗組高于模型組，聯合組高于實驗組（ P <0.05）;模型組DAPK1蛋白相對表達量升高，且聯合組與實驗組低于模型組，聯合組低于實驗組（ P <0.05）。見表2，圖3。

3 討論

DAI是一種常見且危重的顱腦損傷，可導致選擇性大腦白質軸突水腫、軸索斷裂等病理改變，以長時間意識障礙為典型臨床表現，臨床診斷較困難且預后差[10-11]。神經節苷脂是含唾液酸的一類膜糖脂的總稱，是組成細胞膜結構和維持膜功能的基本物質，與軸突的生長、突觸的形成及神經元的分化等密切相關，已被廣泛用于臨床治療脊髓損傷、缺氧缺血性腦病、阿爾茲海默病及糖尿病周圍神經病變等，但由于其單獨使用時療效有限，故常需與相應藥物聯合使用[12]。中醫學理論認為，DAI是由于暴力引起人體內部氣血經絡臟腑受損或功能失調而產生一系列癥狀，屬頭部內傷。傷后氣機不利，閉塞機竅，致患者昏迷不醒;氣為血之帥，血為氣之母，氣血不調是百病發生的根本;傷血必致傷氣，先見氣滯，繼則見氣虛，嚴重者氣脫，瘀血經久不散，損傷難愈，因此，顱腦損傷以氣虛血瘀多見。復方麝香注射液由石菖蒲、麝香、冰片、郁金、廣藿香、薄荷等主要成分組成，石菖蒲、廣藿香、薄荷芳香化濁、行氣化濕、辟穢止嘔，以解痰瘀熱邪諸毒，醒神益智;麝香善于走竄，活血、行氣止痛、開竅醒腦，為醒神回蘇之要藥;冰片有清熱解毒、消腫止痛、去翳明目、通諸竅的功效;郁金疏脾解郁、活血化瘀、清心開竅，全方具有祛痰開竊、醒腦安神之功效，同時也可降低血腦屏障通透性，縮短昏迷時間，減輕腦水腫，改善腦供血、供氧等[13]。藥理研究[14]表明，石菖蒲具有調節中樞神經系統、心血管系統、消化系統與內分泌系統功能的作用;麝香為通關利竅之藥，可顯著減輕腦水腫、改善血液流變性及細胞聚集、抑制炎性反應早期的滲出性水腫等;郁金可改善缺血周圍半暗帶的微循環和血液流變黏稠度。有研究[15]報道，復方麝香注射液治療早期高血壓性腦出血患者，臨床療效顯著，可促進患者神經功能恢復，提高其日常生活能力，利于預后，值得臨床推廣使用。本研究結果顯示，聯合組與實驗組大鼠第1～7天的mNSS評分明顯低于模型組，且聯合組低于實驗組，提示復方麝香注射液與神經節苷脂治療DAI均可改善神經功能缺損情況，緩解病情，且兩藥聯合使用效果更佳。

DAPK1在腦外傷、腦缺血等信號刺激下被激活，可通過多種途徑介導神經元損傷、死亡，損害神經功能;當顱腦損傷時，神經元細胞可大量合成NF200，NF200進而發揮促進神經元功能修復與神經軸突再生的作用;GAP-43具有促進神經發育、軸突再生與突觸重建等作用[16]。有研究[17]顯示，凋亡相關蛋白DAPK1可致腦缺血損傷后神經元細胞凋亡，從而損傷腦神經組織，破壞神經功能。有研究[18]顯示，參芎葡萄糖注射液可促進損傷脊髓的功能恢復，其機制可能與上調損傷區脊髓GAP-43、NF200表達有關。李振華等[19]研究發現，神經節苷脂治療急性脊髓損傷大鼠，可改善脊髓損傷程度，緩解運動障礙，其機制可能與上調B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達，抑制神經元凋亡有關。目前尚無關于復方麝香注射液或神經節苷脂對NF200、GAP-43、DAPK1作用的相關報道，本研究結果顯示，聯合組與實驗組大鼠神經元凋亡指數及腦組織DAPK1蛋白相對表達量均低于模型組，NF200、GAP-43蛋白相對表達量高于模型組，提示復方麝香注射液與神經節苷脂治療DAI均可抑制神經元凋亡，上調腦組織NF200、GAP-43蛋白表達，同時下調DAPK1蛋白表達，從而保護神經細胞，改善神經功能。

綜上所述，復方麝香注射液聯合神經節苷脂治療DAI可改善大鼠神經功能缺損情況，抑制神經元凋亡，上調腦組織NF200、GAP-43蛋白表達，同時下調DAPK1蛋白表達，從而保護神經細胞，改善神經功能，且兩藥聯合使用具有協同作用，這為臨床治療DAI提供了新方向，也為復方麝香注射液與神經節苷脂的推廣應用提供了理論依據。

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（2020-02-05收稿 責任編輯：王明）

基金項目：河北省2016年度醫學科學研究重點課題計劃項目（20160027）作者簡介：宋國智（1969.06—），男，碩士研究生，主任醫師，研究方向：神經外科方向，E-mail：15631008622@163.com