苦參堿對急性髓系白血病SCID模型鼠細胞生物學特性的影響

王穎 阿茹娜 呂鵬

摘要? 目的：觀察苦參堿對急性髓系白血病SCID小鼠模型細胞生物學特性的影響。方法：將40只數字隨機法分為空白組（ n =10）、模型組（ n =30），其中模型組小鼠腹腔注射對數生長期HL-60細胞株制備急性髓系白血病模型，4周后將27只成模的模型組小鼠隨機分為造模組、苦參堿A組及苦參堿B組，每組9只。其中苦參堿A組及B組分別用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃，空白組及造模組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，各組均連續干預4周。比較各組生存期、體質量、外周血血常規變化、同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）水平變化、白血病細胞HL-60各周期生長情況以及Th1/Th2細胞的相關指標水平變化。結果：苦參堿可明顯延長SCID小鼠生存期，減少外周血白細胞、淋巴細胞、HL-60細胞數量、IL-4、IL-10水平，上調PTEN、IFN-γ、IL-2水平、G0/G1期的細胞含量，與造模組比較差異有統計學意義（ P <0.05）。結論：苦參堿對急性髓系白血病HL-60細胞株具有明顯的抑制效應，療效具有一定的劑量依賴性，其作用機制可能與增強PTEN蛋白及調整Th1/Th2細胞平衡有關。

關鍵詞? 急性髓系白血病;SCID模型鼠;HL-60細胞株;苦參堿;PTEN;Th1;Th2;失衡

Effects of Matrine on Cell Biological Characteristics of Acute Myeloid Leukemia SCID Model Mice

WANG Ying，A Runa，LYU Peng

（Department of Hematology，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous region，Huhehaote 010017，China）

Abstract Objective： To observe the effects of matrine on the biological characteristics of SCID mice model with acute myeloid leukemia. Methods： A total of 40 mice were randomly divided into a blank group（ n =10）and a model group（ n =30）.The acute myeloid leukemia model was established by intraperitoneal injection of logarithmic HL-60 cells in the model group.4 weeks later，27 mice in the model group were randomly divided into a model group，a matrine A group and a matrine B group，with 9 mice in each group.The rats in group A and B were given 10 mL/kg and 5 mL/kg respectively by gavage，and the rats in the blank group for 4 weeks and model group were given the same volume of normal saline by gavage for 4 weeks.The survival time，body weight，the changes of peripheral blood routine，the level of homologous phosphatase-tensin（PTEN），the growth of leukemic cell HL-60 and the level of related indexes of Th1/Th2 cells were compared in each group. Results： Matrine could significantly prolong the survival time of SCID mice，decrease the number of leukocytes，lymphocytes，HL-60 cells and the levels of IL-4 and IL-10 in peripheral blood，and increase the levels of PTEN，IFN-γ，IL-2 and G0/G1 cells in the model group. Conclusion： Matrine has obvious inhibitory effects on acute myeloid leukemia HL-60 cell line in a dose-dependent manner，and the curative effects are dependent on dose to some degree.Its mechanism may be related to the enhancement of PTEN protein and regulation of Th1/Th2 cell balance.

Keywords? Acute myeloid leukemia; SCID model mouse; HL-60 cell line; Matrine; PTEN; Th1; Th2; Imbalance

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.013

急性髓細胞白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是以造血祖細胞或干細胞過度增殖、分化異常或凋亡受抑制為主要表現的血液系統惡性腫瘤[1-2]。化療是目前AML的主要治療手段，但醫療費用昂貴、不良反應及耐藥性限制其臨床運用，故探尋新的、安全的抗癌方案具有重要的臨床意義。近年來，中草藥以其抗癌效果明顯、安全性高等諸多優勢被眾多生物、醫學界科研工作者所重視。苦參堿是中草藥苦參的提取物，臨床不乏其有效治療肺癌、肝癌、胃癌等諸多實體腫瘤的臨床報道[3-5]，但其作用機制目前尚未清楚。本研究嘗試通過細胞周期檢測、Western Blotting、ELisa等手段，觀察苦參堿對急性髓系白血病SCID小鼠模型細胞生物學特性的影響，以期為中西結合防治白血病提供有力證據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 40只SPF級SCID小鼠[購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2006-0009]，所有動物飼養于本院動物實驗中心，飼養條件：溫度（22±1.5）℃，濕度（50±2）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 AML細胞株HL-60（購自上海舜冉生物科技有限公司，批號S678）;苦參堿（純度≥98%，配置儲存液濃度為10 mg/mL，購自美國Sigma公司，批號38293）。

1.1.3 試劑與儀器 同源性磷酸酶-張力蛋白單克隆一抗抗體（PTEN，購自美國CST公司，貨號9188T）;IFN-γELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號32462）、IL-2 ELISA試劑盒（ 購自上海西唐生物科技有限公司，貨號39283）、IL-4 ELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號23442）、IL-10ELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號49233）;環磷酰胺（購自湘潭嘉葉源生物科技有限公司，批號XT382）。血細胞分析儀（購自濟南格利特科技有限公司，型號GRT-6002型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 40只小鼠隨機法分為空白組（ n =10）、模型組（ n =30），其中模型組小鼠腹腔注射對數生長期HL-60細胞株制備急性髓系白血病模型，4周后將27只成模的模型組小鼠隨機分為造模組、苦參堿A組及苦參堿B組，每組9只。各組小鼠在體質量、鼠齡各方面差異無統計學意義（ P >0.05），具有可比性。

1.2.2 給藥方法 苦參堿A組及B組每天分別用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃，空白組及造模組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，各組均連續干預4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 各組小鼠一般情況比較 比較干預后各組小鼠生存期、體質量及外周血血常規的變化。

1.2.3.2 Western Blot檢測各組小鼠脾臟組織PTEN水平 干預結束后各組隨機抓取5只小鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出脾臟組織，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF的蛋白裂解液，勻漿后室溫下靜置10 min后，用BCA試劑盒測定樣本總蛋白，根據結果得出上樣量后進行電泳跑膠，轉膜，加入PTEN及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀釋，再進行生物辣根過氧化酶HRP標記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進行處理，測定各樣本灰度值。

1.2.3.3 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度檢測 收集1.2.3.2步驟中大鼠的腹主動脈血，4 ℃ 10 000 r/min下離心5 min，抽吸上清液，使用ELISA（酶聯免疫吸附試驗）對小鼠外周血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度進行檢測，具體過程如下：將樣本滴加如反應孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌反應孔后每孔加入0.1 mL的酶標抗體，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗滌，隨后在各反應孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反應。隨后將反應孔板置于酶標儀中讀取數據，波長設置492 nm。操作過程全部按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學進行數據分析。計量數據都用均數±標準差（? ±s ）表示，組間比較采用兩樣本 t 檢驗或兩樣本秩和檢驗;組內比較采用配對 t 檢驗或配對秩和檢驗。以 P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較 苦參堿組小鼠生存期明顯較模型組延長，其中苦參堿A組生存時間長于苦參堿B組;接受造模的小鼠體質量明顯較空白組下降，差異有統計學意義（ P <0.05），用藥后小鼠體質量有所回升，其中苦參堿A組優于苦參堿B組;苦參堿A組和苦參堿B組外周血白細胞、淋巴細胞以及HL-60細胞的數量較造模組明顯下降（ P <0.05），其中苦參堿A組下降趨勢大于苦參堿B組（ P <0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠的實體瘤的病理變化 苦參堿A組和苦參堿B組PTEN水平較造模組明顯升高（ P <0.05），其中苦參堿A組上調幅度較苦參堿B組明顯（ P <0.05）。見圖1及表2。

2.3 各組HL-60細胞G1期細胞百分比比較 苦參堿干預小鼠G0/G1期的細胞含量明顯多于造模組（ P <0.05）， 且S期明顯少于造模組（ P <0.05），其中苦參堿A組優于苦參堿B組（ P <0.05）。見表3。

2.4 各組外周血IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度變化? 造模組、苦參堿組小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平較空白組降低，IL-4、IL-10水平均較空白組升高（ P <0.05），其中苦參堿A組與苦參堿B組比較改善差異有統計學意義（ P <0.05）。見表4。

3 討論

AML是常見的血液疾病，給家庭及社會帶來巨大打擊，研究AML的治療方案極具臨床意義。AML是造血祖細胞或干細胞過度增殖、分化異常或凋亡受抑制，影響了正常造血功能，廣泛浸潤肝、脾、淋巴等重要臟器， 從而出現貧血、出血、反復感染等不良反應。有研究顯示PTEN蛋白的缺失在AML發生發展過程占據重要意義。PTEN是磷酸酶活性的抑癌基因，廣泛參與諸多細胞生長信號通路，與細胞諸多生物行為密切相關[7-8]。PTEN具有蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性，通過抑制以酪氨酸激酶為主的磷酸化酶的活性而發揮抑制癌細胞生長的作用[9]。本研究制備急性髓系白血病SCID小鼠模型，結果顯示造模組小鼠外周血白細胞、淋巴細胞數量較空白組明顯升高，中性粒細胞較空白組明顯下降，這提示造模成功。造模組小鼠PTEN水平較空白組明顯下降，這提示SCID小鼠模型在被成功制備成急性髓系白血病時機體的PTEN水平下降，抗癌能力減弱。眾所周知癌細胞的生長周期紊亂是導致其異常增殖的關鍵，傳統抗癌藥物多數是通過將癌細胞阻滯于G2/M或者S期而實現治療目的的。本研究通過細胞周期檢測發現造模組小鼠G0/G1期的細胞含量明顯少于其他組，S期細胞含量明顯多于其他組，這說明體內細胞周期調控紊亂，從而導致惡性腫瘤的發生，進一步證實造模成功。

苦參堿是中藥苦參的主要成分，大量臨床藥理研究證實苦參堿具有多種類藥理作用，包括保肝、抗病毒、升高白細胞、抗心血管疾病等。近年來苦參堿 的抗癌效應尤受關注。張文陸等[10]通過研究發現苦參堿可誘導人胃癌細胞SGC-7901的凋亡，從而實現抗胃癌效應;楊靜波等[11]亦通過動物實驗證實苦參堿可抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖，且具有明顯的劑量依賴性。本研究對急性髓系白血病SCID小鼠模型進行檢測，結果顯示苦參堿可明顯延長急性髓系白血病SCID小鼠的生存周期，并且提高其體質量，改善其血細胞的水平。在細胞周期檢測中我們發現苦參堿干預小鼠G0/G1期的細胞含量明顯多于造模組（ P <0.05），且S期明顯少于造模組（ P <0.05），其中苦參堿A組優于苦參堿B組（ P <0.05），提示苦參堿可影響腫瘤細胞的周期而抑制癌細胞增殖，實現抗癌效應，且具有一定的劑量依賴性。

急性髓系白血病患者出現明顯的貧血、出血、發熱、感染等癥狀，有資料[12-14]顯示與免疫功能紊亂關系密切，Th1、Th2細胞廣泛參與機體的免疫應答過程[15-16]，IFN-γ、IL-2是Th1的標志性指標，IL-4及IL-10則是Th2的標志性指標，Th1與Th2處于相互調節、相互抗衡的動態平衡狀態，如果其中指標出現異常，則破壞Th1與Th2的動態平衡[17-18]，急性髓系白血病患者機體亦存在Th1與Th2的動態平衡受破壞，故恢復Th1與Th2的動態平衡是治療該病的關鍵。研究中發現造模組、苦參堿組小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平較空白組降低，IL-4、IL-10水平均較空白組升高，其中苦參堿A組較苦參堿B組改善，提示調整Th1與Th2的動態平衡可能是苦參堿有效治療急性髓系白血病的作用機制之一。

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（2019-05-15收稿 責任編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金項目（81460027）;內蒙古自治區自然科學資助基金項目（2018MS08070）作者簡介：王穎（1980.08—），女，碩士研究生，主治醫師，研究方向：急性白血病的治療，E-mail：cfwy1980@163.com