HPLC法同時測定不同采集地衢枳殼中12種黃酮類成分的含量

馮敬騫　胡衛南　徐禮萍　李姜言　王思為　宋劍鋒

中圖分類號 R282 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）05-0571-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.13

摘 要 目的：建立同時測定衢枳殼中12種黃酮類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Extend C18，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為330 nm，進樣量為10 μL。測定不同采集地的10批衢枳殼樣品中12種黃酮類成分（圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內酯）的含量。結果：圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內酯檢測的質量濃度線性范圍分別為1.65～16.51、4.50～45.02、35.41～354.12、4.11～41.12、2.29～22.86、34.96～349.56、1.42～14.15、1.50～15.04、1.83～18.28、1.51～15.08、1.61～16.12、1.28～12.84? ? ? μg/mL（r均大于0.999 7）;檢測限分別為0.165 1、0.450 2、3.541 2、0.411 2、0.228 6、3.495 6、0.141 5、0.150 4、0.182 8、0.150 8、0.161 2、0.128 4 μg/mL;定量限分別為0.547 8、1.487 4、11.663 3、1.360 3、0.758 3、11.594 9、0.466 3、0.497 1、0.601 2、0.499 9、0.532 3、0.424 6? μg/mL;精密度（n=6）、重復性（n=6）、穩定性（24 h，n=7）試驗的RSD均小于3%;平均加樣回收率分別為99.50%、99.61%、98.18%、98.85%、98.48%、98.50%、98.25%、99.91%、103.13%、98.82%、98.44%、100.29%（RSD=1.49%～2.38%，n=6）。10批不同采集地衢枳殼樣品中，上述12個成分的含量分別為1.995 5～2.648 8、4.317 7～5.005 1、33.215 5～34.054 6、3.140 4～3.471 5、3.221 2～3.748 8、42.746 6～44.026 6、0.202 7～0.239 4、0.191 2～0.208 8、0.080 3～0.097 9、0.291 9～0.307 1、0.119 9～0.149 1、0.082 7～0.089 8 mg/g。結論：建立的含量測定方法準確、可靠、簡便、高效，可用于同時測定衢枳殼中12個黃酮類成分的含量，并為衢枳殼質量控制標準的建立提供了參考依據。

關鍵詞 衢枳殼;黃酮類成分;柚皮苷;新橙皮苷;含量測定;高效液相色譜法

Simultaneous Determination of the Contents of 12 Flavonoids in Quzhiqiao from Different Collection Places by HPLC

FENG Jingqian1，HU Weinan2，XU Liping2，LI Jiangyan3，WANG Siwei4，SONG Jianfeng2（1.School of Medicine， Quzhou College of Technology， Zhejiang Quzhou 324000， China;2.Quzhou Institute for Food and Drug Control， Zhejiang Quzhou 324002， China;3.Dept. of Pharmacy， Quzhou Hospital of TCM， Zhejiang Quzhou 324022， China;4.Dept. of Pharmacy， Quzhou Municipal Peoples Hospital， Zhejiang Quzhou 324000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of the contents of 12 flavonoids in Quzhiqiao. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Extend C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The detection wavelength was set at 330 nm， and sample size was 10 μL. The contents of 12 components （such as eriocitrin， narirutin， naringin， naringenin， hesperidin， neohesperidin， hesperide hydrate， luteolin， hesperide， nobiletin， hesperetin and hesperidolactone） in 10 batches of Quzhiqiao from different collection places were determined. RESULTS： The linear range of eriocitrin， narirutin， naringin， naringenin， hesperidin， neohesperidin， hesperide hydrate， luteolin， hesperide， nobiletin， hesperetin and hesperidolactone were 1.65-16.51， 4.50-45.02， 35.41-354.12， 4.11-41.12， 2.29-22.86， 34.96-349.56， 1.42-14.15， 1.50-15.04， 1.83-18.28， 1.51-15.08， 1.61-16.12， 1.28-12.84 μg/mL， respectively （all r>0.999 7）. The detection limits were 0.165 1， 0.450 2， 3.541 2， 0.411 2， 0.228 6， 3.495 6， 0.141 5， 0.150 4， 0.182 8， 0.150 8， 0.161 2， 0.128 4 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.547 8， 1.487 4， 11.663 3， 1.360 3， 0.758 3， 11.594 9， 0.466 3， 0.497 1， 0.601 2， 0.499 9， 0.532 3， 0.424 6 μg/mL， respectively. RSDs of precision （n=6）， reproducibility （n=6） and stability （24 h，n=7） tests were all lower than 3%. The average recoveries were 99.50%， 99.61%， 98.18%， 98.85%， 98.48%， 98.50%， 98.25%， 99.91%， 103.13%， 98.82%， 98.44%， 100.29% （RSD=1.49%-2.38%， n=6）. The contents of the above 12 components in 10 batches of samples from different collection places were 1.995 5-2.648 8， 4.317 7- 5.005 1， 33.215 5-34.054 6， 3.140 4-3.471 5， 3.221 2-3.748 8， 42.746 6-44.026 6， 0.202 7-0.239 4， 0.191 2-0.208 8， 0.080 3- 0.097 9， 0.291 9-0.307 1， 0.119 9-0.149 1， 0.082 7-0.089 8 mg/g. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable， simple and efficient， which can be used to simultaneous determination of the contents of 12 flavonoids in Quzhiqiao， and to provide reference for the establishment of quality control standards of Quzhiqiao.

KEYWORDS? ?Quzhiqiao; Flavonoids; Naringin; Neohesperidin; Content determination; HPLC

衢枳殼俗稱“胡柚片”，為蕓香科植物常山胡柚（Citrus changshan-huyou Y.B.Chang）的未成熟果實，主產于浙江衢州，一般于每年的6-7月采收。常山胡柚的未成熟果實作為藥用在浙江有很長的歷史，已于2015年作為地方習用藥材收入了《浙江省中藥炮制規范》（2015年版）中，命名為“衢枳殼”[1-2]，為“新浙八味”和“衢六味”的品種之一。衢枳殼在浙江資源豐富、產量高，藥材中主要含有揮發油和黃酮類等成分。衢枳殼具有鎮咳化痰、清熱解毒、調節胃腸道功能、降血糖、降血脂和降血壓等功效，具有較高的開發利用價值[3-5]。

據文獻報道，衢枳殼中的黃酮類成分是其發揮理氣寬中等作用的重要成分，也是評價衢枳殼質量的指標性成分[4，6-8]。前期本課題組采用高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜法（HPLC-Q-TOF-MS）并結合相關成分數據庫初步分析了衢枳殼中的化學成分，顯示其含有多種黃酮類成分。而目前對衢枳殼中多個成分同時檢測的文獻報道較少，雖有采用HPLC法同時測定衢枳殼中7個指標成分含量的文獻報道[9-11]，但尚不能涵蓋衢枳殼中其他指標成分。而中藥一般通過多成分、多靶點發揮協同增效的作用，如能同時測定出其中更多的黃酮類成分的含量，對衢枳殼的質量控制、譜效關系分析和闡明其中的藥效物質基礎都具有重要意義。

為了能更好地控制衢枳殼的質量，本研究選擇衢枳殼中具有主要活性的12個黃酮類成分（圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素和橙皮油內酯）作為定量檢測指標，建立HPLC法同時測定其含量，并應用于來自10個不同采集地的衢枳殼樣品檢測中，以期為完善衢枳殼的質量控制標準提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1316B型柱溫箱、G1312B型泵系統[美國Agilent科技（中國）有限公司];PA2251型電子分析天平[賽多利斯（上海）貿易有限公司];KQ5200E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;HYJD-T型實驗室超純水機（杭州永潔達凈化科技有限公司）;KA-1000C型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

衢枳殼藥材分別于2019年6月采自浙江衢州市10個不同的常山胡柚標準化種植基地，在每個基地的東、南、西、北、中5個方位分別采集樣本（于2019年6月下旬采集后對半切開，50 ℃烘干，封口包裝，備用），由衢州市食品藥品檢驗研究院宋劍鋒主任中藥師鑒定均為常山胡柚的未成熟果實;圣草次苷對照品（批號：CDGB- 89194，純度：98.56%）、橙皮油內酯對照品（批號：CDAA-281288，純度：98.72%）均來源于上海安譜實驗科技股份有限公司;蕓香柚皮苷對照品（批號：131208，純度：98.56%）、柚皮素對照品（批號：130908，純度：98.48%）、桔皮素對照品（批號：130708，純度：98.86%）、川陳皮素對照品（批號：130108，純度：98.75%）均來源于四川省維克奇生物科技有限公司;柚皮苷對照品（批號：110722-201312，純度：98.96%）、橙皮苷對照品（批號：110721-201316，純度：98.88%）、新橙皮苷對照品（批號：111857-201102，純度：98.84%）、木犀草素對照品（批號：111520-201006，純度：98.98%）均來源于中國食品藥品檢定研究院;水合橙皮內酯對照品（批號：BBP00486，純度：98.50%）、橙皮內酯對照品（批號：BBP00392，純度：99.10%）均來源于云南西力生物技術有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、甲酸、乙酸為分析純，均來源于中國醫藥集團上海化學試劑公司;水為超純水（自制）。衢枳殼樣品來源信息見表1。

表1 衢枳殼樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5? ? ? ? μm）;流動相：A相為 0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈溶液，梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：330 nm;進樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內酯12個對照品適量，精密稱定，置于不同量瓶中，加70%甲醇使之溶解并制成質量濃度均為1.0 mg/mL的單一對照品貯備液;精密移取12種對照品貯備液適量，混合，制成含圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內酯質量濃度分別為16.51、45.02、354.12、41.12、22.86、349.56、14.15、15.04、18.28、15.08、16.12、12.84 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取衢枳殼樣品，粉碎，過3號篩;取粉末約0.2 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量;超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，密塞;再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液和供試品溶液（S6）適量，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。結果，各待測成分峰與相鄰峰間的分離度良好，分離度均大于1.5，理論板數以柚皮苷峰計大于? ?4 000，對稱因子為0.95～1.05。

2.3.2 線性關系考察 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，制成系列質量濃度混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標（y）、各成分質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸。結果，12個成分在各自檢測質量濃度范圍內線性關系均良好，結果詳見表3。

表3 12個成分的線性關系考察結果

2.3.3 檢測限與定量限試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加70%甲醇逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時得檢測限，信噪比為10 ∶ 1時得定量限，結果見表4。

表4 12個成分的檢測限與定量限測定結果

2.3.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄各成分的保留時間和峰面積。結果，各色譜峰峰面積的 RSD 為1.68%～2.78%（n=6），表明儀器的精密度良好，詳見表5。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取同一批供試品（S6），平行取樣6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的保留時間和峰面積，并按外標法計算各成分含量。結果，各成分含量的RSD為1.77%～2.98%（n=6），表明該方法的重復性良好，詳見表5。

2.3.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S6），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的保留時間和峰面積。結果，各色譜峰峰面積的RSD 為 1.77%～2.86%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好，詳見表5。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知含量的衢枳殼樣品（S2）粉末6份，精密稱定適量，分別按各成分已知含量的100%加入混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算各待測成分含量并計算加樣回收率。結果，12種成分的平均加樣回收率在98.18%～103.13%之間，RSD在1.49%～2.38%之間，表明本方法的準確度良好，詳見表6。

2.3.8 樣品的含量測定 取不同采集地的10批衢枳殼樣品粉末各約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算各成分含量，每批樣品平行3份測定，取平均值，結果詳見表7。

從表7可知，圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、木犀草素、橙皮內酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內酯等12個黃酮類成分的含量分別為1.995 5～2.648 8、4.317 7～5.005 1、33.215 5～34.054 6、3.140 4～3.471 5、3.221 2～3.748 8、42.746 6～44.026 6、0.202 7～0.239 4、0.191 2～0.208 8、0.080 3～0.097 9、0.291 9～0.307 1、0.119 9～0.149 1、0.082 7～0.089 8 mg/g。其中，常山縣所產的衢枳殼樣品（S1～S4）各成分的含量均高于江山、柯城、衢江和龍游所產樣品（S5～S10）。常山作為衢枳殼的原產地和道地產區，表現出一定的地域優勢，值得進一步研究和開發。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者在前期試驗中采用HPLC-二級管陣列檢測器對12個成分對照品分別進行光譜綜合分析，結果發現在330 nm波長處各成分均有較強紫外吸收，且均無末端吸收，因此選擇以330 nm作為檢測波長。

3.2 提取參數的選擇

在供試品溶液的提取中，筆者對提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（10、20、30 min）、取樣量（0.1、0.2、0.3 g）進行了篩選。綜合考慮所得色譜峰的峰面積、分離度、峰形和供試品制備方法的簡單、高效、易操作等因素，最終確定取樣量為0.2 g，提取溶劑為70%甲醇50 mL，提取方式為超聲，提取時間為30 min。

3.3 色譜條件的考察

在色譜條件的優化中，筆者考察了實驗室常見的幾種色譜柱，即Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Diamond C18（250 mm×46 mm，5 μm）。從保留時間、對稱因子和分離度等方面對供試品溶液的色譜分離效果進行綜合評價，結果各組分均能達到有效分離，其中Agilent Extend C18分離得到的色譜峰峰形良好，分析時間較短，且能在較低的柱壓下實現快速、高效地分離。另外，在25、30、35 ℃的柱溫條件下進行分析發現，不同柱溫下各化合物均能達到有效分離，35 ℃下分離最佳且保留時間較短。

綜上，本文建立的方法準確可靠、簡便、高效，可全面、準確地同時測定衢枳殼中12個指標性成分的含量，從而為衢枳殼質量控制標準的完善提供了參考依據，并為其他枳殼類相關藥材及其炮制品的多指標成分含量的同時測定提供了參考。

參考文獻

[ 1 ] 浙江植物志編輯委員會.浙江植物志[M].杭州：浙江科學技術出版社，1993：438.

[ 2 ] 浙江省食品藥品監督管理局.浙江省中藥炮制規范[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：180-182.

[ 3 ] 徐小忠，趙四清，汪麗霞，等.常山胡柚果皮中所含功能性成分與作用[J].浙江柑橘，2014，31（1）：10-12.

[ 4 ] 徐禮萍，宋劍鋒，趙四清，等.常山胡柚與不同來源枳殼對理氣寬中功能的藥效差異比較[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（7）：156-160.

[ 5 ] 陸勝民，張俊，鄭美瑜，等.常山胡柚營養成分及其保健功能研究進展[J].浙江柑橘，2015，32（1）：2-7.

[ 6 ] 徐霄，汪洋，王思為，等.衢枳殼黃酮組分抑制脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥反應的作用機制研究[J].中國中醫藥科技，2019，26（4）：529-532.

[ 7 ] 王笑笑，王思為，方月娟，等.衢枳殼不同組分體外降糖活性研究及4種黃酮組分含量分析[J].中國現代應用藥學，2017，34（10）：1418-1423.

[ 8 ] 鄭雪良，劉春榮，王登亮，等.胡柚小青果的黃酮類化合物及抗氧化活性研究[J].浙江農業學報，2015，27（7）：1185-1191.

[ 9 ] 黃文康，岳超，宋劍鋒，等. HPLC同時測定衢枳殼中7種指標成分的含量[J].中國現代應用藥學，2018，35（3）：404-407.

[10] 宋劍鋒，馮敬騫，胡建華，等.常山胡柚不同生長期果實中3種成分含量的動態變化[J].中國現代應用藥學，2014，31（12）：1474-1478.

[11] 宋劍鋒，馮敬騫，徐禮萍，等.枳殼與常山胡柚及其多個炮制品的質量評價[J].中國藥房，2015，26（30）：4258-4261.

（收稿日期：2019-09-25 修回日期：2019-11-04）

（編輯：劉 萍）