離子液體-超聲波協同法提取黑豆異黃酮及抗氧化性研究*

黎 莉，于德涵，蘇 適，王廣慧

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061)

黑豆(Glycinemax(L.)Merr.)源產于中國，與大豆同屬豆科植物[1]。黑豆中的異黃酮是普通大豆的5～7倍[2]，具有類雌激素樣、預防心血管病、抗腫瘤以及抗骨質疏松等生理活性，可作為預防和治療多種疾病的保健品和藥物[3-6]，在醫藥領域發揮著不可替代的作用。目前，超聲波法提取中藥材能加強有效成分的溶出，提高提取率[7]。離子液體作為提取劑，具有環境友好、選擇性高、萃取范圍廣等優點，彌補常規方法的不足。本研究首次采用響應曲面法優化離子液體-超聲波輔助提取黑豆異黃酮的提取工藝，為黑豆異黃酮相關產品的開發和進一步研究提供參考。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青仁黑豆：購自農貿市場。

金雀異黃酮標準品(純度 98%)，中國藥品生物制品檢定所；[Bmim]BF4(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽)、[Bmim]Cl (1-正丁基-3-甲基咪唑氯)、[Emim]Br(溴化-1-乙基-3-甲基咪唑)[Bmim]Br(溴化-1-丁基-3-甲基咪唑)、[Omim]Br(溴化-1-己基-3-甲基咪唑),純度均為97%，阿爾法試劑有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析純)，美國 Sigma 公司；抗壞血酸(分析純)，天津市福晨化學試劑廠；無水乙醇(分析純)，國藥試劑有限公司。

1.1.2 儀器設備

DL-1000E超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；小型高速粉碎機，無錫久平儀器有限公司；VIS-721紫外分光光度計， 渡揚精密儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 標準曲線

參考文獻方法[8]，準確稱取染料木素標準品1.0 mg，用95%的乙醇制成濃度為 1 mg/mL的標準溶液，分別量取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL的標準溶液，置于10 mL的容量瓶中定容，在 260 nm處測吸光度。以濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得回歸方程Y=0.1126x，R2=0.9979。

1.2.2 黑豆異黃酮的提取

黑豆粉碎→過60目篩→正己烷，脫脂 2 次→離子液體-超聲提取→提取液離心→含量測定。

1.2.3 提取量的計算

按1.2.1項下方法測定其吸光度，并根據回歸方程，計算黑豆異黃酮的提取量。

(1)

式中：R為異黃酮提取量，mg/g；C為測得濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數；M為原料質量，g。

1.2.4 提取工藝優化

準確稱取已脫脂的黑豆粉末2.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆異黃酮，采用0.8 mol/L的[Bmim]BF4、[Bmim]Cl、[Emim]Br、[Bmim]Br、[Omim]B五種離子液體為提取溶劑，離子液體濃度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol·L-1)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g·mL-1)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)對黑豆異黃酮提取量的影響。

1.2.5 響應面實驗設計

根據單因素實驗，選擇離子液體濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)，以異黃酮提取量為響應值，根據Box-Behnken Design中心組合設計原理，建立響應回歸模型，因素水平見表1。

2 結論與討論

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 離子液體濃度對提取量的影響

由圖1可知，黑豆異黃酮的提取量隨離子液體濃度增大而增加，當離子液體濃度超過0.6 mol/L時，提取量開始下降。可能是離子液體濃度小，離子液體與異黃酮分子接觸概率低，故提取量低；但是離子液體的濃度過高，會增大溶液的黏度，很難滲入到細胞的內部，降低了對異黃酮的溶出[9]。因此，選擇離子液體濃度 0.6 mol/L。

圖1 離子液體濃度對提取量的影響

2.1.2 提取時間對提取量的影響

圖2 提取時間對提取量的影響

由圖2可知，異黃酮的提取量隨提取時間的延長而增加，當提取時間超過50 min時，提取量開始下降。可能是提取時間過短，異黃酮不能充分浸出。在超聲波空化作用和機械震動的持續作用下，延長提取時間異黃酮溶出增加，提取量升高。但細胞內的膠質和色素、蛋白等成分也會同時溶出，提取量下降[10]。因此，超聲時間選擇50 min。

2.1.3 料液比對提取量的影響

圖3 液料比對提取量的影響

由圖3可知，黑豆異黃酮的提取量隨料液比的增大而增加，當料液比超過1:25(g/mL)時，提取量開始下降。可能是料液比過小，離子液體粘度較大，不利于異黃酮的溶出。料液比超過1:25(g/mL)，溶劑會對超聲波有一定的吸收效應，對異黃酮溶出作用減弱，提取量降低[11]。因此，料液比選擇1:25(g/mL)。

2.1.4 超聲功率對提取量的影響

圖4 超聲功率對提取量的影響

由圖4可知，超聲波功率從200 W 增長到350 W時，異黃酮的提取量明顯增加，但功率大于350 W后，提取量開始下降。可能是超聲波會導致植物細胞運動加劇，加速了異黃酮的釋放；但超聲功率過高會破壞異黃酮的分子結構[12]，提取量下降。因此，超聲功率選擇350 W。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面設計及結果

表2 響應面實驗設計方案

續表2

24-10015.08825-10105.0152611004.017270-1014.65828-100-14.592290-10-13.753

2.2.2 響應面的建立與分析

采用Design-Expert8.0軟件對表2中的數據進行分析，以黑豆異黃酮提取量(Y)為響應值，得到各因子的二次回歸擬合方程為：

Y=0.65+0.070A+0.037B+6.167×10-3C+0.047D+0.044AB+0.030AC-0.022AD-0.018BC-0.061BD+0.069CD-0.089A2-0.086B2-0.13C2-0.023D2

表3 方差分析表

注：p>0.05為不顯著；p<0.05為顯著；p<0.01為極顯著。

2.2.3 響應面分析

采用Box-Behnken 軟件對離子液體濃度、提取時間、液料比和提取溫度之間兩兩交互作用關系進行分析。響應曲面坡度越陡峭，表明黑豆異黃酮提取量對于操作條件的改變越敏感；反之，如果響應面坡度越平緩，說明提取因素的改變對響應值越不敏感。圖5中各因素相互作用得到的等高線均為橢圓形。由圖5(a)可知，離子液體濃度和料液比對黑豆異黃酮提取量的交互作用極顯著，當離子液體濃度為 0.57 mol/L，料液比為1:21時，異黃酮提取量達到最大；從等高線圖可知，離子液體濃度對異黃酮提取量影響比超聲時間更為顯著。由圖5(b)可知，提取時間和料液比對黑豆異黃酮提取量的交互作用極顯著，當超聲時間為40 min，料液比為1:21時，異黃酮提取量達到最大；從等高線圖可知，提取時間對異黃酮提取量影響比料液比更為顯著。實驗結果與模型的方差分析結果一致。

圖5 等高線及響應曲面圖

2.2.4 驗證實驗

結合單因素實驗，分析回歸模型，經過驗證，最終得出該提取方法準確可靠。黑豆異黃酮的最佳提取條件：離子液體濃度0.57 mol/L，提取時間40.16 min，料液比1:21.65，超聲功率度357 W，理論預計值6.14 mg/g。考慮實際操作，選擇離子液體濃度0.57 mol/L，提取時間40 min，料液比1:21，超聲功率度350 W，進行5次平行實驗，平均值為0.611%，與預測值0.614%接近，說明預測模型與實際情況擬合較好。

3 結 論

本文首次采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆異黃酮，得到最佳工藝條件為：離子度0.57 mol/L，提取時間40 min，料液比1:21，超聲功率度350 W，在此條件下黑豆異黃酮的提取量可達6.11 mg/g。采用離子液體為提取劑較傳統提取方法有很大的提高[8-9]，縮短了提取時間，所需溶劑少，離子液體可重復利用，是一種快速高效提取黑豆異黃酮的理想方法。