基于超高效液相色譜-蒸發光散射檢測技術優選炒酸棗仁-醋五味子藥對最佳配伍比例

吳溪，孟楣，高家榮

基于超高效液相色譜-蒸發光散射檢測技術優選炒酸棗仁-醋五味子藥對最佳配伍比例

吳溪，孟楣，高家榮

安徽中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031

通過超高效液相色譜-蒸發光散射檢測技術測定不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對中酸棗仁皂苷A含量，優選最佳配伍比例，為臨床用藥提供參考。設置不同劑量配比的炒酸棗仁-醋五味子藥對（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1），采用Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），蒸發光散射檢測器，乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量1 μL，酸棗仁皂苷A色譜峰與相鄰色譜峰的分離度不低于1.5，測定藥對中酸棗仁皂苷A含量。酸棗仁皂苷A在0.010 05～0.100 5 μg范圍內呈良好線性關系，回歸方程為＝1 276 209.888 91－162 396.863 01（＝0.999 93），重復性、穩定性和回收率良好。上述9個不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對的酸棗仁皂苷A濃度依次為0.015 9、0.015 3、0.016 9、0.011 4、0.013 7、0.013 2、0.018 4、0.014 6、0.010 3 mg/mL。本研究揭示炒酸棗仁-醋五味子配伍比例為7∶3時酸棗仁皂苷A含量最高，可為臨床養心安神治法遣方用藥提供依據。

超高效液相色譜-蒸發光散射檢測法；炒酸棗仁-醋五味子藥對；配伍比例；酸棗仁皂苷A

酸棗仁、五味子兩藥在中醫經典安神方劑中多配伍使用，是臨床常用藥對之一，該藥對具有滋陰養血、安神鎮驚、消除疲勞、增加耐力等功效，用于治療神經衰弱、失眠癥、消渴、慢性蕁麻疹等。本課題前期采用計算機編程及關鍵詞映射法，對以《中醫方劑大辭典》為基礎的中醫方劑數據庫進行檢索并手工檢索2015年版《中華人民共國藥典》，發現含有酸棗仁-五味子藥對的方劑262首，二者的配伍比例有44種，以1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、2∶3居多[1]。通過查閱其他文獻得到藥對的配伍比例一般按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行研究[2]，與統計比例比較接近，因此確定上述9個比例對酸棗仁-五味子藥對進行研究。酸棗仁-五味子藥對配伍多以酸棗仁為主，故以酸棗仁為主要研究目標。酸棗仁皂苷是酸棗仁中含量高的化學成分，其中達瑪烷型三萜皂苷類化合物如酸棗仁皂苷A是酸棗仁中最重要的皂苷。現代藥理研究表明，酸棗仁皂苷類是其鎮靜安神的主要藥效成分，與化學類鎮靜催眠藥相比，酸棗仁活性成分有多靶點、多效應器官等特點[3-5]。本研究采用超高效液相色譜-蒸發光散射檢測（UPLC-ELSD）技術測定酸棗仁皂苷A含量，從而優選酸棗仁-五味子藥對的最佳配伍比例，為臨床中醫方劑配伍提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀，Acquity ELSD檢測器及Waters Empower2軟件（美國Waters公司），Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）。

酸棗仁皂苷A對照品（批號110734-200509，含量99.9%），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司），水為屈臣氏純凈水，其他試劑均為分析純。酸棗仁藥材產地為河北贊皇縣，五味子藥材產地為遼寧丹東市，經安徽中醫藥大學第一附屬醫院孟楣主任中藥師鑒定，分別為鼠李科植物酸棗Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子和木蘭科植物五味子（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，依據《安徽省中藥飲片炮制規范》炒黃方法和醋制方法[6]對酸棗仁和五味子藥材分別進行炮制，得到炒酸棗仁和醋五味子。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），ELSD檢測器，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量1 μL，流動相A為乙腈、B為水，梯度洗脫程序見表1[7-9]。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

時間流動相A流動相B 0 min 20.080.0 1.5 min 40.060.0 2.5 min 40.060.0 3.5 min 70.030.0 4.0 min100.00 5.0 min 20.080.0 7.0 min 20.080.0

2.2 對照品溶液制備

精密稱取酸棗仁皂苷A對照品適量，加甲醇250 mL制成0.020 1 mg/mL的對照品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，置5 ℃冰箱備用。

2.3 供試品溶液制備

分別取炒酸棗仁、醋五味子（過2號篩，24目），按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例稱量，得到1～9號樣品（見表2），分別置于50 mL圓底燒瓶中，將粉末混勻，精密加入60 mL甲醇，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，分別加入10 mL蒸餾水溶解，倒入離心管中，3000 r/min離心5 min，取上清液，加石油醚（60～80 ℃）萃取3次，每次15 mL，棄去石油醚層，水層加入5%KOH溶液30 mL，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和氨水洗滌2次，每次10 mL，棄去洗液，揮干正丁醇，殘渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，即得。

表2 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對樣品（g）

編號炒酸棗仁醋五味子 11.0049.008 22.0038.002 33.0037.001 44.0036.001 55.0025.004 66.0024.005 77.0013.000 88.0032.002 99.0021.000

2.4 陰性對照溶液制備

取醋五味子，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 系統適用性試驗

取對照品溶液、供試品溶液（1號）和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，酸棗仁皂苷A保留時間為4.1 min，酸棗仁皂苷A色譜峰與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，表明樣品中的酸棗仁皂苷A分離度良好，陰性對照及其他成分無干擾。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照

2.5.2 線性關系的考察

精密吸取對照品溶液，制成酸棗仁皂苷A濃度分別為2.01、4.02、8.04、12.06、16.08、20.1 μg/mL的系列溶液，各進樣5 μL。以酸棗仁皂苷A濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程＝1 276 209.888 91－162 396.863 01，＝0.999 93。結果表明，酸棗仁皂苷A在0.010 05～0.100 5 μg范圍內線性關系良好。

2.5.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，結果RSD＝0.12%，表明精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗

取2號供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h按“2.1”項下色譜條件測定酸棗仁皂苷A的峰面積，結果RSD＝0.14%，表明溶液在12 h內穩定性良好。

2.5.5 重復性試驗

取2號樣品6份，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，計算酸棗仁皂苷A含量，結果RSD＝0.92%，表明重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

按照2號樣品比例分別減半稱取樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算加樣回收率，結果平均回收率為96.81%，RSD＝1.62%，見表3。

表3 酸棗仁皂苷A加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 1.0010.076 40.060 300.134 1595.8 1.0230.074 70.060 300.132 2995.5 1.0170.075 20.060 300.133 9497.4 1.0200.075 00.075 380.149 4898.8 1.0050.076 10.075 380.150 2398.396.811.62 1.0350.073 90.075 380.145 3794.8 1.0130.075 50.090 450.165 0398.9 1.0050.076 10.090 450.162 3695.4 1.0510.072 80.090 450.160 0396.4

2.6 樣品含量測定

分別吸取9個配伍比例的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算酸棗仁皂苷A含量，結果見表4，酸棗仁皂苷A濃度變化見圖2。可見，隨著炒酸棗仁配伍劑量增大、醋五味子配伍劑量減小，酸棗仁皂苷A的濃度變化呈波型；當炒酸棗仁與醋五味子配伍比例為7∶3時，酸棗仁皂苷A含量最高。

表4 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對酸棗仁皂苷A濃度

樣品編號炒酸棗仁∶醋五味子酸棗仁皂苷A/（mg/mL） 11∶90.015 9 22∶80.015 3 33∶70.016 9 44∶60.011 4 55∶50.013 7 66∶40.013 2 77∶30.018 4 88∶20.014 6 99∶10.010 3

圖2 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對中酸棗仁皂苷A濃度變化曲線

3 討論

本研究預試驗中比較了加熱回流提取法和超聲提取法，結果發現加熱回流1 h可使酸棗仁皂苷A充分溶出，因此選擇加熱回流提取法進行供試品的提取。深入比較樣品溶液的預處理方法，對于回流提取后樣品直接蒸干定容和樣品蒸干后增加一系列處理步驟2種方法進行比較，后者效果較好，通過石油醚萃取除去脂溶性成分，以及其他溶劑的洗滌，可避免雜質的干擾。

酸棗仁皂苷A為三萜皂苷類成分，紫外吸收效果差，不宜采用二極管陣列檢測器，而蒸發光散射檢測器為質量型通用檢測器，可檢測揮發性低于流動相的化合物。本試驗將超高效液相色譜用于酸棗仁皂苷A的研究，經UPLC-ELSD測定，與普通HPLC采用C18填料的色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）比較，分析速度提高了4倍以上，具有較高的分析通量，同時也具有良好的準確度、精密度和耐用性，方法可靠，重復性好。

酸棗仁與五味子從古至今有多種炮制方法，及至現代，酸棗仁的主要炮制方法為清炒，五味子主要為醋制。研究表明，酸棗仁通過炒制能夠達到“生效熟增”的目的，主要與藥效相關的主要化學成分含量變化有關[10]。中藥制劑發揮藥理、藥效作用與其化學成分含量和配伍比例密切相關，中藥量效關系是確定臨床用藥劑量的依據，也是確保用藥有效性和安全性的基礎。前期文獻研究表明酸棗仁與五味子藥對配伍以酸棗仁為主，但最佳配伍比例并不確定。本試驗通過考察酸棗仁主要有效成分酸棗仁皂苷A含量變化，結果顯示炒酸棗仁與醋五味子的最佳配伍比例為7∶3，在化學成分上為炒酸棗仁與醋五味子的合理配伍提供了依據，可指導臨床遣方用藥。

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Optimization Compatibility Ratio of Fried Ziziphi Spinosae Semen-Vinegated Schisandra Chinensis Fructus Based on UPLC-ELSD Technique

WU Xi, MENG Mei, GAO Jiarong

To determine the contents of Jujubaside A with different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus based on UPLC-ELSD technique; To select the best compatibility ratio; To provide references for clinical medication.Different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen and vinegated Schisandra Chinensis Fructus were set as 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, and 9:1. Acquity UPLC BEHC18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) was used as the chromatographic column to detect the contents of Jujubaside A; acetonitrile-water (gradient elution) was used as the mobile phase with 0.3 mL/min flow rate; the detector was ELSD; the column temperature was 30 ℃; the volume was 1 μL. The separation of Jujubaside A chromatographic peak from adjacent chromatographic peaks was not less than 1.5. The contents of Jujubaside A with different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus were detected.The regression equation of Jujubaside A was=1 276 209.888 91- 162 396.863 01 (=0.999 93) in the range of 0.010 05–0.100 5 μg, showing a good linear relationship. The repeatability, stability and recovery rate were fine as well. The concentrations of Jujubaside A were 0.015 9, 0.015 3, 0.016 9, 0.011 4, 0.013 7, 0.013 2, 0.018 4, 0.014 6, 0.010 3 mg/mL in the above nine different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus.When the compatibility ratio of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus is 7:3, the content of Jujubaside A is the highest, which can provide references for prescribing and medication of clinical method of tranquilizing by nourishing the heart.

UPLC-ELSD; fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus; compatibility ratios; Jujubaside A

R284.1

A

1005-5304(2020)06-0065-04

10.3969/j.issn.1005-5304.201904234

安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2012Z220）；安徽中醫學院青年科學研究基金（2013qn009）

高家榮，E-mail：zyfygjr2006@126.com

（2019-04-16）

（2019-05-08；編輯：陳靜）