文心蘭高效再生體系的建立

李雪青 盛玉輝 付瑛格 周揚(yáng) 趙瑩 凌鵬 宋希強(qiáng) 王健

摘要：【目的】建立文心蘭高效再生體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以文心蘭檸檬綠的無菌苗葉片為材料，探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對其原球莖誘導(dǎo)的影響，開展增殖、生根及移栽研究，建立其高效穩(wěn)定的再生體系。【結(jié)果】影響文心蘭原球莖誘導(dǎo)的3種植物生長調(diào)節(jié)劑主次排序為萘乙酸（NAA）>噻苯隆（TDZ）>6-芐氨基嘌呤（6-BA），在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA和0.3 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.0%。培養(yǎng)基中活性炭含量及碳水化合物種類對文心蘭原球莖增殖的影響存在明顯差異，不同活性炭含量處理間的原球莖增殖系數(shù)存在顯著差異（P<0.05，下同），添加1.0 g/L活性炭較添加0.5 g/L活性炭的增殖系數(shù)顯著升高，不同碳水化合物種類間的原球莖增殖系數(shù)排序為海藻糖>麥芽糖>蔗糖，最佳增殖和分化培養(yǎng)基為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。添加10%椰子水的文心蘭幼苗生根數(shù)顯著高于添加10%香蕉汁和10%蘋果汁，每株平均生根量接近4.00條，即生根效果最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水。移栽過程中根部用水苔包裹后再移至椰糠中，保證光照、水分適宜，適當(dāng)添加緩釋肥，移栽成活率可達(dá)100%。【結(jié)論】利用海藻糖或麥芽糖作為碳源的文心蘭原球莖增殖效果較優(yōu)，生根數(shù)和生根質(zhì)量優(yōu)勢明顯;不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比、碳源和有機(jī)物的添加對文心蘭組織培養(yǎng)具有明顯的促進(jìn)效果。

關(guān)鍵字： 文心蘭;再生體系;原球莖;增殖;生根;移栽

中圖分類號： S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1169-07

Abstract：【Objective】In order to provide support for the varieties improvement of Oncidium using transgenic technology， an efficient regeneration system was established. 【Method】 Leaves of sterile plantlets of Oncidium Lemon Green were used as materials. The effects of different plant growth regulators for the induction of protocorms were researched. The proliferation， rooting and transplanting methods were studied and the efficient regeneration system was established.【Result】The most efficient plant growth regulator for the protocorm induction was naphthaleneacetic acid （NAA）， followed by thiabendron（TDZ） and 6-benzylaminopurine（6-BA）. 1/2MS medium with 0.5 mg/L NAA， 0.5 mg/L 6-BA and 0.3 mg/L TDZ harvested the highest induction rate of 48.0%. The different activated charcoal contents and carbohydrates in media had obvious different effects on protocorm proliferation efficiency， protocorm proliferation times treated by different activated charcoal contents had significant difference. The treatment of 1.0 g/L activated charcoal significantly increased proliferation coefficient than that of 0.5 g/L. Protocorm proliferation coefficients of different carbohydrates was trehalose>maltose>sucrose. The optimal medium for proliferation and differentiation was 1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L activated charcoal+20 g/L trehalose. The rooting number of Oncidium seedlings in the medium with 10% coconut juice was significantly higher than that with 10% banana juice or 10% apple juice， and the average root number per plant was about 4.00. The best rooting medium was 1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10% coconut juice. The roots were then wrapped with moss and the shoots were moved in coconut husk， and the survival rate of transplanted plantlets could reach 100% in the proper light and moisture environment while the slow-release fertilizers were used appropriately. 【Conclusion】Trehalose or maltose as carbon source can obviously improve the proliferation of protocorms of Oncidium，while the root number and quality are greatly increased. The different ratios of plant growth regulators， the different carbon source types and organic matters have obvious promotion effects on regeneration of Oncidium.

Key words： Oncidium; regeneration system; protocorm; proliferation; rooting; transplanting

Foundation item： Hainan Major Science and Technology Project（zdkj201815）; Operation Service Reward Project of National Forest Germplasm Resources Service Platform（hdzkpt2019001）

0 引言

【研究意義】文心蘭（Oncidium）又名舞女蘭、跳舞蘭，是蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）植物，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)（Chase et al.，2009;徐小雁等，2011;王安石等，2015）。因其花序分枝良好、花形優(yōu)美、花色亮麗，被插花界譽(yù)為切花“五美人”之一，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值（邵寒霜等，2000;陳華和范燕萍，2012;吳曉佩，2017）。近年來，文心蘭作為重要的切花和盆花種類，其市場需求量急劇增加，成為洋蘭類的新寵（李力，2016）。海南是我國文心蘭切花的主要產(chǎn)區(qū)之一（柯海麗等，2012），但切花品種以黃色為主，花色較單一，且無香味，不符合人們?nèi)找娑鄻踊男枨螅嬖诒皇袌鎏蕴娘L(fēng)險。利用成熟的基因工程技術(shù)可快速培育具備多種花色和香味的文心蘭新品種，對促進(jìn)文心蘭產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，而建立文心蘭高效再生體系是實(shí)施基因工程的前提條件。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)蘭科植物再生體系的建立已有較多報道。樊家榮等（2014）利用1/2MS培養(yǎng)基對大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）鱗莖進(jìn)行類原球莖誘導(dǎo)，得出植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳濃度配比為0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA），增殖分化的最佳天然復(fù)合物為150 mL/L椰汁，添加100 g/L香蕉泥對幼苗根生長有顯著促進(jìn)作用。Sherif等（2016）在寶石蘭（Anoectochilus）再生體系研究中提出一種通過愈傷組織器官發(fā)生并成功誘導(dǎo)形成植株的方法，且證實(shí)利用不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑[6-BA、NAA、噻苯隆（TDZ）、呋喃氨基嘌呤（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚-3-乙酸（IAA）]附加檸檬酸、蛋白胨、椰子水和香蕉泥等天然復(fù)合物能有效提高愈傷組織的增殖率。盧娟（2017）發(fā)現(xiàn)采用低濃度的6-BA附加椰汁和香蕉泥等天然復(fù)合物可促進(jìn)蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite Rchb. F.）原球莖增殖。在文心蘭方面，Chen和Chan（2000）以花莖再生植株的節(jié)間、葉片和根尖為材料，采用1/2MS培養(yǎng)基附加適宜比列TDZ和2，4-D及1 g/L蛋白胨暗培養(yǎng)4～7周，成功誘導(dǎo)出胚性愈傷;金蘋（2009）以試管苗葉片為材料，利用1/2MS培養(yǎng)基+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA成功誘導(dǎo)出原球莖;張超等（2010）探討不同基本培養(yǎng)基、碳源和植物生長調(diào)節(jié)劑對原球莖增殖的影響，結(jié)果表明，MS為原球莖的最佳增殖培養(yǎng)基，10 g/L果糖為原球莖的最佳增殖碳源，0.01～0.10 mg/L NAA能促進(jìn)原球莖增殖，且單獨(dú)添加1.0 mg/L 6-BA時原球莖的增殖效果優(yōu)于與NAA配合使用;林鶴延（2012）以文心蘭和石斛蘭（Dendrobium nobile）原球莖為材料進(jìn)行蘭花反義ACS基因轉(zhuǎn)化并對轉(zhuǎn)基因蘭花原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)與再生;黃霞和盧禹（2016）通過分析不同濃度配比TDZ和2，4-D對文心蘭愈傷組織增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加1.0 mg/L TDZ和3.0 mg/L 2，4-D后，從接種的類原球莖（PLBs）上可誘導(dǎo)出乳白色、較疏松的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)100%，成功建立了文心蘭高頻再生體系;王亞平等（2016）以迷你文心蘭玉香和金香為材料，建立了迷你文心蘭的離體快繁技術(shù)體系;葉秀仙等（2016）以文心蘭豹斑寶石的花梗為外植體，探究其叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響因素，旨在建立叢生芽組培快繁體系;馬蘭（2019）以1/2N6培養(yǎng)基+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為文心蘭繼代增殖及幼苗生長培養(yǎng)基取得良好效果。【本研究切入點(diǎn)】檸檬綠是海南文心蘭切花的主要品種之一，經(jīng)濟(jì)價值高，可作為改良花色花香的品種，但至今未見有關(guān)該品種再生體系建立的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以文心蘭檸檬綠的無菌苗葉片為材料，探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對其原球莖誘導(dǎo)的影響，開展增殖、生根及移栽研究，進(jìn)而建立高效再生體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

文心蘭檸檬綠無菌苗由海南博大蘭花科技有限公司提供。

1. 2 原球莖誘導(dǎo)

取生長健壯、完整的無菌苗幼葉，切成長1.0 cm、寬0.5 cm的葉片片段，在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA（0、0.5和2.0 mg/L）、6-BA（0、0.5和1.0 mg/L）和TDZ（0、0.3和0.6 mg/L）等植物生長調(diào)節(jié)劑組合，按正交試驗設(shè)計L9（3）4進(jìn)行優(yōu)化，每處理接種外植體30個，重復(fù)3次，置于組培室中培養(yǎng)7周后觀察誘導(dǎo)效果，并統(tǒng)計其誘導(dǎo)率和死亡率。誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)數(shù)/接種數(shù)×100，死亡率（%）=死亡數(shù)/接種數(shù)×100，其中誘導(dǎo)數(shù)為誘導(dǎo)出原球莖的數(shù)目。

1. 3 原球莖增殖及分化

將原球莖接種在4種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖與分化培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種原球莖50粒，重復(fù)3次。培養(yǎng)基①：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭+30 g/L蔗糖;培養(yǎng)基②：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+30 g/L蔗糖;培養(yǎng)基③：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L麥芽糖;培養(yǎng)基④：1/2 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖粒數(shù)并計算增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=（現(xiàn)有粒數(shù)-原有粒數(shù)）/原有粒數(shù)，比較分析培養(yǎng)基中活性炭含量及不同碳水化合物對增殖的影響。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計分化數(shù)并計算分化率，分化率（%）=分化原球莖數(shù)/總原球莖數(shù)×100。

1. 4 生根培養(yǎng)

以不添加天然復(fù)合物的培養(yǎng)基1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為對照，將分化出的幼苗接種于添加不同天然復(fù)合物（分別為10%的香蕉汁、椰子汁或蘋果汁）的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每處理接種30個幼苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)60 d后觀察生根情況、統(tǒng)計生根數(shù)，并計算平均生根數(shù)，平均生根數(shù)（條）=生根條數(shù)/原有株數(shù)。

1. 5 移栽

選取株高約4.0 cm、根長2.0～3.0 cm、生長健壯的幼苗進(jìn)行移栽。先將已生根的組培苗置于室溫下1 d，然后揭開組培瓶蓋在室外散色光下煉苗2～3 d，取出小苗以清水洗凈根部培養(yǎng)基，稍晾干后用水苔包裹幼苗根部，移植到椰糠基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計成活率。

1. 6 培養(yǎng)條件

除特殊說明外，培養(yǎng)基中均添加30 g/L蔗糖和5.8 g/L瓊脂，pH 5.6，光照強(qiáng)度1500 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度25 ℃。

1. 7 統(tǒng)計分析

利用Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理和制圖，以SPSS 25.0進(jìn)行單因方差分析、LSD多重比較及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同濃度NAA、6-BA和TDZ對文心蘭葉片誘導(dǎo)原球莖的影響

以文心蘭無菌苗葉片為材料，利用正交試驗研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對原球莖誘導(dǎo)的影響。由表1可看出，通過極差分析發(fā)現(xiàn)因素A（NAA）的R值最大（23.000），而因素B（6-BA）的R值最小（3.567），表明影響文心蘭原球莖誘導(dǎo)的3種植物生長調(diào)節(jié)劑主次排序為NAA>TDZ>6-BA。結(jié)合誘導(dǎo)率的LSD多重比較分析結(jié)果可知，處理1～3與處理4～9間的原球莖誘導(dǎo)率存在顯著差異（P<0.05，下同），其中，處理5（圖1-A）的誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.0%，其次為處理9（圖1-B）。在死亡率方面，處理9的死亡率最低，僅8.0%。方差分析結(jié)果（表2）顯示，NAA對原球莖誘導(dǎo)率的影響最大，達(dá)顯著水平，而6-BA和TDZ對誘導(dǎo)率的影響均不顯著（P>0.05，下同）。綜上所述，文心蘭原球莖誘導(dǎo)的最優(yōu)配方組合是A2B2C2，即1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L TDZ。

2. 2 活性炭含量及碳水化合物種類對文心蘭原球莖增殖的影響

由圖2可看出，培養(yǎng)基中活性炭含量及碳水化合物種類對文心蘭原球莖增殖的影響存在明顯差異，以培養(yǎng)基④的增殖系數(shù)最大（2.87），培養(yǎng)基①的增殖系數(shù)最小（0.45）。經(jīng)LSD多重比較發(fā)現(xiàn)，不同活性炭含量處理間的原球莖增殖系數(shù)存在顯著差異，添加1.0 g/L活性炭較添加0.5 g/L活性炭的增殖系數(shù)顯著升高;不同碳水化合物種類間表現(xiàn)為添加麥芽糖或海藻糖的原球莖增殖系數(shù)無顯著差異，但二者均極顯著高于添加蔗糖的增殖系數(shù)，其原球莖增殖系數(shù)排序為海藻糖>麥芽糖>蔗糖。即文心蘭原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，所有增殖的原球莖在原培養(yǎng)基上再經(jīng)30 d左右培養(yǎng)，均可分化出幼苗（圖3），分化率達(dá)100%。

2. 3 不同天然復(fù)合物對文心蘭幼苗生根的影響

將分化獲得的正常生長文心蘭幼苗接種在添加不同天然復(fù)合物的培養(yǎng)基（1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）上進(jìn)行生根培養(yǎng)，其生根率均為100%，但生長狀況及平均生根數(shù)存在差異。與對照相比，添加天然復(fù)合物處理的文心蘭幼苗生根數(shù)均極顯著增加（圖4），生長狀況和顏色也較對照優(yōu)（圖5）。在不同天然復(fù)合物處理間，添加10%椰子水的生根數(shù)顯著高于添加10%香蕉汁和10%蘋果汁，每株平均生根量接近4.00條，添加10%香蕉汁和10%蘋果汁的生根數(shù)間無顯著差異。因此，文心蘭幼苗生根效果最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水。

2. 4 文心蘭生根組培苗的移栽結(jié)果

將生長良好、具有3～4片葉的文心蘭再生幼苗置于自然室溫下煉苗3～4 d再進(jìn)行移栽，移栽過程用水苔包裹根部以保證其濕潤，轉(zhuǎn)移至椰糠穴盤中采用水苔椰糠基質(zhì)進(jìn)行幼苗培養(yǎng)（圖6），每隔2～3 d以浸盤法進(jìn)行澆水，保證光照條件充足，移栽15 d后噴施50%多菌靈可濕性粉劑600～800倍液，并適當(dāng)添加緩釋肥，30 d后其成活率達(dá)100%。

3 討論

NAA和6-BA是常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，對文心蘭原球莖的增殖和分化具有重要作用（金蘋，2009）。6-BA與NAA配伍使用既有利于原球莖的增殖及分化，又有利于幼苗生根，可有效提高組培苗質(zhì)量（彭立新等，1999）。本研究結(jié)果表明，不同濃度的6-BA和NAA對文心蘭原球莖誘導(dǎo)增殖均有影響。在原球莖誘導(dǎo)方面，0.5～1.0 mg/L 6-BA有利于文心蘭原球莖誘導(dǎo)，而NAA濃度為0.5 mg/L的誘導(dǎo)效果最佳，說明在一定濃度范圍內(nèi)，6-BA和NAA均有利于文心蘭原球莖誘導(dǎo)，與李力（2016）、曾武清等（2017）、郭艷芳（2018）的研究結(jié)果基本一致;在原球莖增殖方面，較高濃度（4.0 mg/L）6-BA配合較低濃度（0.4 mg/L）NAA可獲得較高的增殖系數(shù)，與崔廣榮等（2005）的研究結(jié)果相似。TDZ具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂活性，低濃度可誘導(dǎo)蘭科植物原球莖或愈傷組織發(fā)生（王濟(jì)紅等，2013）;高濃度則抑制愈傷組織形成，促進(jìn)其分化（徐華松等，1996）。在本研究中，文心蘭原球莖誘導(dǎo)率也受TDZ濃度影響，在0.3～0.6 mg/L范圍內(nèi)，TDZ對誘導(dǎo)率的提高具有一定促進(jìn)作用，但與未添加TDZ的誘導(dǎo)率無顯著差異，可能與文心蘭的品種有關(guān)系，具體原因有待進(jìn)一步探究。

碳水化合物是組織胚轉(zhuǎn)化成小植株的重要物質(zhì)（Jheng et al.，2006）。Pullman等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥芽糖取代蔗糖時可提高冷杉組織胚的植株轉(zhuǎn)化效率，并促進(jìn)其體細(xì)胞胚成熟，可能是麥芽糖作為一種優(yōu)良的碳水化合物滲透劑在關(guān)鍵時期能促進(jìn)冷杉組織胚發(fā)育。Jheng等（2006）通過研究碳源對文心蘭PLBs形成和植株再生的影響，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加麥芽糖和蔗糖對PLBs的增殖有促進(jìn)作用，但海藻糖較麥芽糖更有利于植株轉(zhuǎn)化。張超等（2010）研究表明，不同碳源對文心蘭原球莖增殖效果的排序為果糖>蔗糖>葡萄糖>麥芽糖>山梨醇>甘露醇，以添加10 g/L果糖的增殖效果最佳。本研究結(jié)果表明，添加20 g/L海藻糖對文心蘭原球莖的增殖有促進(jìn)作用，添加麥芽糖也有類似作用效果，與Jheng等（2006）的研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0 g/L活性炭對文心蘭原球莖增殖有明顯促進(jìn)作用，可能是活性炭能吸附組培過程中植物分泌的有害次生代謝物質(zhì)。此外，活性炭與不同碳水化合物配伍使用的原球莖增殖效果更好，增殖系數(shù)最高可達(dá)2.87，增殖效果優(yōu)于單獨(dú)使用活性炭（李力，2016）。

在文心蘭生根培養(yǎng)基中添加適量天然復(fù)合物如香蕉汁、椰汁和蘋果汁等可有效促進(jìn)增殖、生根，究其原因可能是此類天然復(fù)合物中富含氨基酸、植物激素、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分（何松林等，2003）。彭曉明等（2000）研究發(fā)現(xiàn)添加香蕉汁、椰乳、番茄汁或蘋果汁的培養(yǎng)基對文心蘭增殖和壯苗生根均有促進(jìn)效果;趙麗和田維敏（2008）也發(fā)現(xiàn)在文心蘭高效再生體系中添加10%椰子水及1.0 mg/L IBA能有效誘導(dǎo)生根。至今，已有較多研究證實(shí)添加椰子水和椰乳等能取得良好的原球莖增殖分化效果，可能是椰乳中含有的營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)配比與蘭花原球莖增殖及分化所需的配比一致（張梅等，2019）。在本研究中，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水，且組培苗根數(shù)多、植株更濃綠、根生長更健壯，較滿若君（2007）、趙麗和田維敏（2008）的研究效果更優(yōu)。文心蘭原球莖誘導(dǎo)率還與葉片選擇有關(guān)。按照以下要求選擇葉片有利于誘導(dǎo)：葉片長、寬分別為1.0和0.5 cm，切口平整，不過嫩（從上到下第1～2片葉子）、不太老（從上到下數(shù)第6片葉子后的葉片），因為老葉易變黃，過嫩葉片則易萎蔫，均不利于誘導(dǎo)。

4 結(jié)論

利用海藻糖或麥芽糖作為碳源的文心蘭原球莖增殖效果較優(yōu)，生根數(shù)和生根質(zhì)量優(yōu)勢明顯;不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比、碳源和有機(jī)物的添加對文心蘭組織培養(yǎng)具有明顯的促進(jìn)效果。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）