N-cadherin在膽管癌組織表達及意義

張峰偉 楊自華 郭平學 常盼 于軍 岳樹強

(1.西安醫學院第二附屬醫院肝膽外科，陜西 西安 710038;2西安醫學院第二附屬醫院科研科，陜西 西安 710038;3.第四軍醫大學西京醫院肝膽外科，陜西 西安 710038)

膽管癌(Cholangiocarcinoma)來源于膽管細胞，發病隱匿且惡性程度高[1]。患者出現臨床癥狀就醫時往往病程至晚期，錯過了最佳治療時間。膽管癌近年在人群中的發病呈上升趨勢，且其具有診斷困難、侵襲強、轉移早、預后差等特點，因此研究促使膽管癌細胞發生侵襲轉移的分子，以便早期控制膽管癌的進展成為亟待解決的問題。目前諸多臨床研究[2]發現，細胞發生惡性侵襲的基礎是上皮間質間轉換(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，鈣黏蛋白在EMT的發生時的表達變化明顯。N-鈣黏蛋白(N-cadherin)也稱作鈣粘著蛋白2(CDH2)，由906個氨基酸組成、位于人體18q11.2染色體上CDH2基因編碼完成的分子量約140 kd的單戀跨膜糖蛋白[3]。已報道[4]N-cadherin在多種腫瘤中升高，如卵巢癌、胃癌、黑色素瘤等，如卵巢癌患者病情進展過程中，發生EMT，N-cadherin的表達增高，進一步促進了卵巢癌的侵襲轉移及病情的發生發展。本研究將西安醫學院第二附屬醫院和第四軍醫大學西京醫院近五年的80例膽管癌患者的癌組織及癌旁組織為研究對象，探討N-cadherin在膽管癌組織中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2019年6年在西安醫學院第二附屬醫院和第四軍醫大學西京醫院治療并經病理科確診進行手術切除的80例膽管癌組織及相應的癌旁組織(≥2 cm)，相應組織被切除后立即放入液氮罐中儲存備用。所有臨床資料均從原始病例本中獲得。此次臨床試驗已經通過西安醫學院第二附屬醫院和第四軍醫大學西京醫院倫理委員會的審查(編號：L2011015)，患者均簽署知情同意書。患者中男50例、女30例；年齡37～81歲、平均(59.02±9.39)歲；患者術前均未接受放化療等治療。嚴格按照國際抗癌聯盟(UICC)頒布的第八版惡性腫瘤TNM分期標準進行膽管癌的TNM分期[5]。

1.2實驗方法 根據美國Invitrogen公司的Trizol試劑盒說明書，提取組織中的總RNA：液氮研磨將樣本裂解后，進行抽提、漂洗及洗脫操作。總RNA分離后用Nano Rrop 2000檢測，日本Takara公司反轉錄試劑盒獲互補DNA。SYBR Green I法進行q-PCR分析。檢測膽管癌組織的N-cadherin mRNA水平，內參為GAPDH mRNA的表達水平。引物列表如下：N-cadherin上游引物5’-TGAAGTCCCCAATGTCTCCA-3’；N-cadherin上游引物5’-GCATCATCATCCTGCTTATCC-3’；GAPDH上游引物5’-AAGGTGAAGGTCGGA GTCAA-3 ’，GAPDH下游引物5’-GGAAGATG GTGATGGGATTT-3’。結果均重復3次取平均值后進行分析。

2 結 果

2.1膽管癌組織與癌旁組織的N-cadherin mRNA水平 RT-PCR結果顯示，膽管癌組織中N-cadherin mRNA(3.42±0.98)的水平高于癌旁組織(2.05±0.64)，差異具有統計學意義(t=10.43，P=0.00)。且與癌旁組織相比較，80例中有72例膽管癌組中的N-cadherin mRNA升高，8例膽管癌組織的N-cadherin mRNA降低，見圖1。

圖1 膽管癌組織與癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值

2.2膽管癌組織/癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值與臨床病理參數間的聯系 結果發現N-cadherin mRNA在膽管癌組織/癌旁組織的比值與患者的性別、年齡無關(P>0.05)，而與患者的TNM分期、分化的程度、淋巴結轉移及神經浸潤有關(P<0.05)。見表1。

表1 膽管癌組織/癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值與臨床病理參數間的聯系

2.3N-cadherin的mRNA對膽管癌的診斷價值 結果發現膽管癌組織/癌旁組織的N-cadherin mRNA AUC面積為0.88，Cutoff值為2.50，診斷敏感性為83.75%，特異性為77.50%，P=0.00。見圖2。

圖2 N-cadherin的mRNA對膽管癌的診斷價值

3 討 論

膽管癌屬于膽道系統高發、侵襲強、預后差的惡性腫瘤，近年來可能由于人們生活習慣及居住環境的改變，發病率逐年遞升[6]。現代生物學研究表明，腫瘤細胞向周圍組織侵襲是腫瘤轉移的基礎，與細胞間的粘附功能有關。EMT的基本條件是細胞形態、粘附及遷移力的變化，具體分子表現包括N-cadherin的表達上調等。基于EMT在腫瘤發生中的重要作用，有可能成為治療膽管癌的新靶點。N-cadherin最初在神經細胞及纖維母細胞上被發現，N-cadherin的胞內片段與存在于細胞骨架上的連環蛋白相互作用，胞外同相鄰細胞上的同種分子相互連接，不僅向細胞內傳導信號，還參與細胞間的粘附功能。目前發現N-cadherin的表達異常增高促進前列腺癌血管生成、增強黑色素瘤、卵巢癌、食管癌等細胞的侵襲能力[7]。有研究[8]報道上調黑色素瘤細胞中N-cadherin的表達時，癌細胞的侵襲能力明顯增強；敲除黑色素瘤細胞中的N-cadherin基因時，癌細胞的細胞周期阻滯，停留在G1期。另有研究[9]分析骨肉瘤患者血液中N-cadherin時發現，N-cadherin表達水平高的患者預后明顯差于N-cadherin表達水平低的人。其分子機制可能是：過表達的N-cadherin蛋白激活MAPKERK信號通、誘導MMPS基因的表達、加速腫瘤的血管形成、促進腫瘤細胞的生長及侵襲；此外，過表達N-cadherin與PDGFR、FGFR等分子相互作用激活PI3K、MAPK等信號通路，促進腫瘤細胞的分裂增殖，加速腫瘤的發生發展[10]。本研究結果發現，N-cadherin在膽管癌組織的表達明顯高于癌旁組織，高、中分化組織的表達明顯比低分化組織低(P<0.05)，提示N-cadherin與生物學行為有關，且分化越差，表達越高。此外，此次實驗結果發現N-cadherin的異常表達與患者的年齡、性別無明顯聯系，但與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移、神經浸潤有關，且晚期N-cadherin的表達明顯高于早期，提示N-cadherin與膽管癌的發生發展及侵襲轉移密切相關。ROC結果顯示：N-cadherin AUC面積為0.88，診斷敏感性為83.75%，特異性為77.50%，這些回顧性的研究提示N-cadherin 對膽管癌具有診斷價值，可能可以成為膽管癌治療的新靶標基因，在臨床前及臨床科研的研究中發揮前瞻性的作用。

綜上所述，N-cadherin mRNA在膽管癌組織的表達升高，且生物學行為越差、分期越晚，其表達量越高。