利用非靶向代謝組學方法研究龍膽瀉肝湯治療急性肝損傷的機制

張艷 王爽 李永哲 宋爽

摘要：以龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當歸、木通、柴胡和甘草組成的龍膽瀉肝湯為試材，采用氣相色譜-質譜技術，并結合代謝組學的方法研究龍膽瀉肝湯對大鼠急性肝損傷（ALI）的治療作用及機制。結果表明，龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI的作用，其機制與影響丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸、4-羥基脯氨酸、檸檬酸和吲哚乳酸8個具有特征性的內源性生物標志物有關，這些標志物屬于三羧酸循環，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生5個代謝途徑。龍膽瀉肝湯能改善ALI大鼠的癥狀，調節ALI大鼠代謝通路異常，具有明顯的保肝作用。

關鍵詞：龍膽瀉肝湯;急性肝損傷;標志物;代謝組學;氣相色譜-質譜

中圖分類號： R285.5 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0208-06

收稿日期：2019-04-17

基金項目：吉林省教育廳科學技術項目（編號：JJKH20190825KJ）;吉林市科技創新發展計劃（編號：201831779）。

作者簡介：張 艷（1981—），吉林吉林人，博士，副教授，主要從事藥理學和代謝組學研究。E-mail：zhangyan@jlict.edu.cn。

龍膽瀉肝湯是我國的傳統中藥復方方劑，由龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當歸、木通、柴胡、甘草組成，最早由汪昂在《醫方集解》中提出，主要用于治療肝膽實火上炎癥[1]。現代藥理學研究表明，龍膽瀉肝湯具有調節免疫[2-3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、鎮痛[7]，調節消化系統功能[8]等作用。此外，黃芩、山梔子等中草藥形態優美，花朵秀麗，將中草藥種植用于園林綠化工程中，既節省了苗木投入，又可以從藥材種植中獲得一定的經濟收益，具有較高的園林開發價值。

我國傳統的中藥方劑是以多味中藥協同的形式組成的復方制劑，倡導聯合用藥以及整體性。根據傳統中醫理論，中藥方劑以每味中藥的有效成分協調發揮藥理作用的形式治療疾病，“整體大于部分之和”是方劑作用的基本特征[9]。代謝組學是20世紀末發展起來的一門新興技術，它借助于現代的分析手段，通過考察生物體系受疾病擾動后其代謝產物的變化，系統地揭示疾病的發展過程和分子機制[10]。其整體性的特點與中醫理論不謀而合，因此代謝組學可以為中藥方劑復雜的作用機制研究提供新方法，對于提高其臨床療效和安全性，促進中醫藥的進一步發展具有重要意義[11]。

急性肝損傷（ALI）是一種源于病毒性肝炎、藥物誘導、乙醇、毒物和肝臟局部缺血而導致的以肝細胞大量壞死為主要特征的急性肝功能障礙[12]。ALI是多種嚴重肝病（如肝硬化、肝癌等）的誘因，嚴重或持續的損傷最終可導致肝衰竭[13]。據估計在世界范圍內，每100萬ALI患者中有8位患者會最終導致肝衰竭，其發病率和死亡率逐年升高，給家庭和社會帶來了沉重的負擔[14]。本研究借助高通量、高靈敏度、高分辨率的氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用分析手段，利用代謝組學方法，研究篩選龍膽瀉肝湯對ALI的治療作用并探尋其代謝組學機制，為開發龍膽瀉肝湯的新用途提供相關數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 SPF級SD大鼠，體質量為 200～240 g，雄性，購自吉林大學白求恩醫學院動物試驗中心，試驗許可證號：SCXK（吉）2016-0002。

1.1.2 藥物與試劑 龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當歸、木通、柴胡、甘草，購自北京同仁堂藥店;以6 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 12 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 8 ∶ 20 ∶ 16 ∶ 6比例配伍（共784 g），5倍水量煎煮3次，每次2 h，合并濾液，濃縮至480 mL（即相當于3 mg/mL生藥量的藥液）備用。N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS），購自上海麥克林公司;乙腈，色譜純，購自美國Fisher公司;吡啶、二十二烷、正庚烷、四氯化碳（CCl4）均為分析純，購自北京化學試劑廠;谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（AST）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒，購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 Chemray 24型全自動生化分析儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司;GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀（配備EI離子源，AOC-20i自動進樣器），日本島津公司;HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），美國Agilent公司;H2050R型低溫高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機，寧波新芝科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 30只SD大鼠，適應性飼養7 d后，隨機分為3組：空白對照組，模型對照組、龍膽瀉肝湯組。空白對照組、模型對照組給予水，龍膽瀉肝湯組給予10 mL/kg的龍膽瀉肝湯藥液（即相當于30 mg/kg生藥量），連續灌胃給藥 7 d，末次給藥后6 h，除空白對照組給予花生油 2 mL/kg 腹腔注射外，模型對照組、龍膽瀉肝湯組按2 mL/kg腹腔注射50% CCl4花生油（V/V）1次，建立ALI模型。造模后24 h，腹主動脈取血，分離血清，取肝臟部分進行組織病理學檢查，部分-80 ℃保存。

1.2.2 血清肝功能指標的測定 以全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.2.3 肝組織樣品前處理 取適量（約1.0 g）肝臟加2倍重生理鹽水，以電動玻璃勻漿機研磨制成勻漿，放置于4 mL離心管中于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，移取上清液100 μL于1.5 mL離心管中，加入250 μL乙腈，混懸3 min，冰浴超聲10 min，于 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清液200 μL于1.5 mL離心管中冷凍干燥。冷凍干燥后，加入 50 μL 衍生化試劑[V（BSTFA） ∶ V（TMCS）=99 ∶ 1]和50 μL吡啶，于80 ℃水浴反應0.5 h，1 h后加含0.10 g/L二十二烷的正庚烷150 μL，混勻后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，移取上清液到 1.5 mL 離心管，用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS條件 參考文獻方法[15-16]設置GC-MS條件如下：進樣口溫度：280 ℃;分流比為10 ∶ 1;載氣：He;流速：1.88 mL/min;柱溫程序：起始溫度60 ℃，保持3 min后，以4 ℃/min的速度升溫，升溫到290 ℃，290 ℃保持10 min。進樣量：0.2 μL。離子源和接口溫度分別為200 ℃和 300 ℃;電子能量：0.85 eV;溶劑延遲：5.5 min;全掃描模式，掃描范圍35～600 m/z。

1.3 數據處理與分析

GC-MS工作站自動獲取總離子流（TIC）圖和離子片段譜。采用XCMS Online對得到的TIC圖進行峰提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作，采用SIMCA-P 13.0進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（O-PLS-DA）。篩選出 VIP>1且P<0.05的數據，利用NIST數據庫、METLIN數據庫、HMDB數據庫進行標志物鑒定。利用MetaboAnalyst進行熱圖分析和代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 龍膽瀉肝湯對ALI大鼠血清ALT、AST和ALP的影響

從表1可以看出，與空白對照組比較，模型對照組血清ALT、AST和ALP水平極顯著升高（P<001）;與模型對照組比較，龍膽瀉肝湯能顯著降低ALI血清中的ALT、AST和ALP水平（P<0.05），表明經龍膽瀉肝湯治療后ALI損傷有所減輕。

2.2 龍膽瀉肝湯對ALI大鼠肝臟組織病理學的影響

從圖1可以看出，空白對照組大鼠肝臟組織未見任何異常;模型對照組肝臟組織肝小葉結構紊亂不清，肝細胞明顯變性及氣球樣變性，小區出現多量炎細胞浸潤，匯管區大量炎細胞浸潤及明顯纖維結締組織增生;經龍膽瀉肝湯治療后肝細胞壞死情況有明顯改善，部分區域存在肝細胞稍有輕微水腫，但大部分肝細胞結構正常，偶見氣球樣變。

2.3 龍膽瀉肝湯治療ALI大鼠的代謝組學機制

2.3.1 代謝輪廓分析 通過XCMS Online軟件構建完整的TIC（圖2）。采用SIMCA-P 13.0對肝勻漿代謝物進行PCA分析，由PCA（圖3）可以看出，空白對照組，模型對照組、龍膽瀉肝湯組能夠分開并且呈明顯的聚類特征。空白對照組樣本主要聚集在PCA圖的下方，模型對照組樣本主要聚集在PCA圖的上方，給予龍膽瀉肝湯治療后，樣本點的分布逐漸向下方移動，與模型對照組分離且有向空白對照組趨近的趨勢。

2.3.2 標志物的鑒定 分別對空白對照組、模型對照組龍膽瀉肝湯組和模型對照組進行O-PLS-DA分析，得出O-PLS-DA、S-plot（圖4）。S-plot圖遠離原點，VIP>1.0且P<0.05的代謝物被認為是潛在的生物標志物。經過篩選鑒定最終確定了8種化合物為生物標志物（表2），分別為丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸、4-羥基脯氨酸、檸檬酸和吲哚乳酸。其中與空白對照組比較，模型對照組中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸和檸檬酸含量下降（P<0.05），肌氨酸、4-羥基脯氨酸和吲哚乳酸含量升高（P<0.05），而龍膽瀉肝湯組中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸和檸檬酸含量較模型組有顯著升高（P<0.05），肌氨酸、4-羥基脯氨酸和吲哚乳酸含量降低（P<0.05）。

2.3.3 熱圖分析 利用MetaboAnalyst生成可視化熱圖以概述空白對照組、模型對照組和龍膽瀉肝湯組生物標志物的強度情況。從圖5可以看出，每列表示空白對照組、模型對照組和龍膽瀉肝湯組，增加的表達式值從綠色到紅色編碼。從熱圖中可以看出龍膽瀉肝湯組中生物標志物有向空白對照組轉移的趨勢。

2.3.4 代謝通路分析 通過數據庫的匹配和相關文獻的查閱，利用MetaboAnalyst對鑒定的8種生物標志物進行相代謝通路分析（表3）。選取影響因子（pathway impact）>0.05的代謝通路為主要的影響通路，即三羧酸（TCA）循環，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生5個代謝途徑是與ALI的最相關代謝途徑（圖6）。

3 結論與討論

CCl4在體內經肝臟的細胞色素P450酶系統可生物轉化成大量的活性氧自由基，進而引起細胞膜的脂質過氧化[17]。ALT和AST是存在于肝細胞內的2種轉氨酶，一旦肝細胞膜發生脂質過氧化，肝細胞膜損傷，ALT和AST就會釋放入血[18]。因此，血液中ALT和AST水平異常升高是ALI的特征標志[19]。此外，ALP也是與ALI密不可分的判斷指標[20]。經龍膽瀉肝湯治療后，ALI大鼠ALT、AST和ALP水平明顯降低，表明龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI的作用。

CCl4引起的ALI可以導致肝臟線粒體的氧化損傷[21]。據相關研究，線粒體是肝臟能量代謝的主要場所，氧化損傷狀態下，線粒體能量代謝受阻[22]。丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸均參與丙酮酸代謝、TCA循環和糖酵解途徑。與空白對照組比較，模型對照組丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸水平均降低，表明ALI狀態下，丙酮酸代謝、TCA循環和糖酵解途徑介導的能量代謝受阻。與模型對照組比較，龍膽瀉肝湯組丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸水平上升，表明龍膽瀉肝湯通過調節丙酮酸代謝、TCA循環和糖酵解途徑可以改善ALI能量代謝異常。

乙醛酸和二羧酸代謝與體內的氧化反應有關，擾動此代謝可間接導致TCA循環異常[23]。檸檬酸是乙醛酸和二羧酸代謝與TCA循環的共同產物，模型對照組檸檬酸水平降低，表明經CCl4刺激后，模型對照組大鼠出現了乙醛酸和二羧酸代謝的異常。龍膽瀉肝湯可通過升高檸檬酸水平，調節此代謝通路而發揮保肝作用。

甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝與氧化損傷引起的炎癥密切關系[24]。炎癥導致細胞氧化損傷加劇，進而引起機體對甘氨酸、色氨酸代謝的水平異常[25]。肌氨酸和L-別蘇氨酸屬于甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，與空白對照組比較，模型對照組甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝異常升高，表明在ALI狀態下，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝異常。經龍膽瀉肝湯治療后，肌氨酸和L-別蘇氨酸降低，表明龍膽瀉肝湯還可以通過調節抗甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝水平改善機體的氧化損傷，發揮保肝作用。

綜上所述，龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI作用，其機制與影響TCA循環，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生等通路有關。

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