let-7a通過(guò)抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路減少腦出血大鼠神經(jīng)元調(diào)亡*

楊 慧，萬(wàn) 廣，高絢照，柳 毅，王守春

（1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，河南新鄉(xiāng)453100；3吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，可導(dǎo)致原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，是腦卒中最危險(xiǎn)的亞型之一。在ICH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，神經(jīng)元凋亡、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡可引起離子穩(wěn)態(tài)紊亂、水腫、出血、興奮性毒性、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等自毀性病理變化，最終導(dǎo)致殘疾，甚至死亡[1]。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等各種細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用，其獨(dú)特的表達(dá)譜在調(diào)節(jié)血管疾病中具有重要作用[2]。在細(xì)胞中，miRNA控制程序性死亡（凋亡和自噬）；在大腦中，miRNA控制神經(jīng)元分化和凋亡，如miR-125b、miR-132和miR-128參與調(diào)控神經(jīng)元分化[3]；miR-365和miR-146a、miR-196b等參與神經(jīng)元凋亡通路調(diào)控。在哺乳動(dòng)物中，miRNA let-7a參與細(xì)胞的分化和凋亡，具有抗增殖作用[4]。在神經(jīng)干細(xì)胞中，let-7a在分化過(guò)程中高表達(dá)[5]，失活可以阻止生長(zhǎng)因子缺失的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。吳美華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在ICH引起的腦水腫中，let-7a下調(diào)了0.5倍。在此基礎(chǔ)上，本研究將研究let-7a對(duì)ICH后神經(jīng)元凋亡的作用及分子機(jī)制，旨在為ICH治療尋找新的靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

材料和方法

1 動(dòng)物

48只健康Sprague-Dawley（SD）大鼠取自新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK（川）2019-218，體重250～280 g。在溫度（25±1）℃、濕度60%的SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，晝夜節(jié)律12 h。

2 主要試劑和儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 let-7a激動(dòng)劑（agomir）、陰性對(duì)照（negative control，NC）agomir、let-7a拮 抗 劑（antagomir）、NC antagomir、let-7a模擬物（mimic）和 NC mimic由百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供；Ⅶ型膠原酶、LipofectamineTM2000和PVDF膜購(gòu)自Invitrogen；DMEM培養(yǎng)基（Yaji，PM150210）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；PC0001）、20× TBS（T1080）和HE染色試劑盒（G1120）均購(gòu)自Solarbio；甲醛（SSBT，SS24273）；PBS（聯(lián)邁生物，LM0221 A）；microRNA熒光定量PCR試劑盒（KALANG，KL190）；蛋白酶K溶液（源葉，R21066）；二甲苯（古朵，GD-RY1215-12）；TRIzol LS試劑（Invitrogen，10296010）；2× SYBR Green qPCR Master Mix（Labio，LBS201）；水合氯醛（經(jīng)科，JKLN006718）；TdT酶緩沖液（JR01891）和TdT酶反應(yīng)液（JR01888）均購(gòu)自上海君瑞；Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，E1910）；抗 phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）抗體（9255）、抗絲裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3，MAP4K3）抗體（92427）、抗 phospho-SEK1/MKK4（Ser257）抗體（514）、抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（80788）、抗 cleaved PARP（Asp214）抗體（5625）和cleaved caspase-3（Asp175）抗體（9661）均購(gòu)自Cell Signaling Technology）。HEK293T細(xì)胞（ATCC，CMH010）。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 凈化工作臺(tái)（Boxun，SW-CJ-2FD）；生物顯微鏡（OLYMPUS，BX43）；恒溫培養(yǎng)箱（DAIHAN，WIG-105）；PCR擴(kuò)增儀（ABI，7900型）；倒置熒光顯微鏡（Nikon，Ti2系列）。

3 主要方法

3.1 ICH建模 隨機(jī)選取40只SD大鼠注射10%水合氯醛麻醉，置于俯臥位，固定于立體定向架上。用牙鉆（顱骨前0.2 mm、中線靠右3 mm）鉆出一個(gè)1 mm的小孔，微量進(jìn)樣器緩慢垂直進(jìn)針5.6mm，定位于近內(nèi)囊的蒼白球內(nèi)。將2 μLⅦ型膠原酶（0.5 UⅦ型膠原酶用2 μL生理鹽水稀釋）以0.4 μL/min的速度注入，留針5min后緩慢拔出，ICH模型構(gòu)建成功。剩余8只SD大鼠作為假手術(shù)（sham）組。

3.2 分組及處理 將造模后的ICH大鼠隨機(jī)分為5組：model組、let-7a agomir組、NC agomir組、let-7a antagomir和NC antagomir組，每組8只。在側(cè)腦室鉆一個(gè)1 mm的毛刺孔（顱骨后0.8 mm，中線右側(cè)1.5 mm，4.5 mm 深的位置），將 10 μmol/L的 let-7a agomir、NC agomir、let-7a antagomir和NC antagomir以0.5 μL/min的速度各注射5μL。造模7 d后，由3名不知情觀察人員對(duì)所有大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)由運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡測(cè)試組成，參照Z(yǔ)ea-Longa的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均無(wú)動(dòng)物死亡。

3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞的密度接種于6孔板，孵育過(guò)夜。將let-7a mimic或NC mimic轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 HE染色觀察病理?yè)p傷 取大鼠血腫周圍腦組織，制作為10 μm厚的切片，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取5個(gè)切片，進(jìn)行HE染色分析。根據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。首先固定切片，沖洗，并用蘇木精和伊紅染色。切片在梯度乙醇下逐漸脫水，充分干燥，用中性樹(shù)脂密封，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.5 RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)RNA相對(duì)表達(dá)水平 將腦組織在液氮中研磨成粉末，100 mg組織加入1 mL TRIzol LS提取總RNA。使用TRIzol LS試劑提取星形膠質(zhì)細(xì)胞中的總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物與2×SYBR Green Master Mix（Labio）結(jié)合，使用ABI 7900型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL。PCR條件為：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＞38被定義為無(wú)法檢測(cè)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品之間的相對(duì)倍數(shù)變化。每組重復(fù)3次。GFAP的上游引物序列為5'-CTCAATGCTGGCTTCAAGGAGA-3'，下游引物序列為5'-GACGCAGCGTCTGTGAGGTC-3'；let-7a的上游引物序列為5'-AGGATCCAAAGGTGGTGGTAAGAGGGTGAT-3'，下游引物序列為5'-AGTCGACATAAGACAAGAAGCAAAAGGTTT-3'；MAP4K3的上游引物序列為5'-GCAAAGCCATCCCAAGTT-3'，下游引物序列為5'-GTGCCTCTATGTTCATTCTGTT-3'；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

3.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的水平 提取各組腦組織蛋白質(zhì)，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。在室溫下用5%BSA在TBS中封膜1 h。用I抗[GFAP（1∶1 000）、MAP4K3（1∶1 000）、JNK（1∶2 000）、MKK4（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、cleaved PARP（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 200）]在 TBST（TBS中含 0.1%Tween-20）中與PVDF膜4℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后在室溫下與相應(yīng)II抗孵育2 h。提取40 μg蛋白質(zhì)用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。GAPDH為內(nèi)參照。最后用蛋白圖像處理軟件和Quantity One軟件分別掃描X膠片和條帶灰度。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況 斷頸處死大鼠，取神經(jīng)組織制作為10 μm厚的切片，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取5個(gè)切片，進(jìn)行TUNEL染色分析。將切片置于染色缸中，用二甲苯洗滌2次，每次5 min；無(wú)水乙醇洗滌2次，每次3 min；95%乙醇和75%乙醇3 min各洗1次；用PBS洗滌2次，每次5 min。加入蛋白酶K溶液（20 mg/L）水解20 min，去除蛋白。蒸餾水洗4次。色缸中加入含有2%過(guò)氧化氫的PBS，反應(yīng)15 min；PBS洗滌2次，每次5 min。用濾紙吸去切片上多余液體，添加2滴TdT酶緩沖液放置3 min；用濾紙吸去多余液體，立即添加50～80 μL的TdT酶反應(yīng)液，37℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min。加入轉(zhuǎn)化劑-POD孵育25 min；PBS洗滌4次，每次5 min。加入5%DBA底物溶液，顯色5～10 min；蒸餾水洗滌4次，每次1 min。甲基綠復(fù)染10 min，蒸餾水洗滌3次，正丁醇洗滌3次，最后用二甲苯脫水3次，每次2 min。中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。采用ImageJ軟件來(lái)統(tǒng)計(jì)每張圖片上的細(xì)胞總數(shù)（包括凋亡和未凋亡的細(xì)胞）和呈現(xiàn)棕黃色的凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.8 let-7a與MAP4K3的靶向關(guān)系 使用生物信息學(xué)軟件TargetScan對(duì)let-7a和MAP4K3的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，并用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)螢光素酶活性，進(jìn)一步驗(yàn)證靶向關(guān)系。用PCR擴(kuò)增含有l(wèi)et-7a結(jié)合位點(diǎn)的MAP4K3基因的3'UTR序列。將MAP4K3的3'UTR克隆到pMIR-REPORT螢光素酶載體中，成為pMIR-MAP4K3-WT。通過(guò)PCR擴(kuò)增MAP4K3 3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的突變，同樣克隆到pMIR-REPORT載體中，成為pMIRMAP4K3-MUT。根據(jù)LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將let-7a mimic/NC mimic和pMIR-MAP4K3-WT/pMIRMAP4K3-MUT共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS清洗細(xì)胞2次，在每孔細(xì)胞中加入100 μL裂解緩沖液（Passive Lysis Buffer，PLB），室溫下震蕩15 min，收集細(xì)胞裂解液。取20 μL PLB加入發(fā)光板中，用GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取背景值；每個(gè)樣本加入100 μL LAR II工作液，快速混勻、讀值；每個(gè)樣本再加入 100 μL Stop＆Glo Reagent，快速混勻后，放入發(fā)光板中檢測(cè)、讀值。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析后，再用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 let-7a過(guò)表達(dá)降低了神經(jīng)功能評(píng)分

利用神經(jīng)功能評(píng)分和HE染色觀察病理?yè)p傷。結(jié)果顯示，let-7a agomir組的神經(jīng)功能評(píng)分較模型組和 NC agomir組顯著降低（P＜0.05），而 let-7a antagomir組的評(píng)分則明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。RT-qPCR檢測(cè)大鼠血腫周圍腦組織let-7a表達(dá)水平顯示，let-7a agomir組中l(wèi)et-7a表達(dá)水平比模型組和NC agomir組增加了數(shù)倍（P＜0.01），而let-7a antagomir組相比模型組和NC antagomir組let-7a表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。從HE染色可以看出，與模型組和NC agomir組相比，let-7a agomir組的病理?yè)p傷最輕，而與模型組和NC antagomir組相比，let-7a antagomir組的病理?yè)p傷最嚴(yán)重。上述結(jié)果表明，let-7a過(guò)表達(dá)降低了神經(jīng)功能評(píng)分，減輕了腦組織病理?yè)p傷。

Figure 1.Protective effect of let-7a over-expression on the rat brain tissues.A：the neurological function score；B：the expression of let-7a was detected by RT-qPCR；C：the brain injury observed by HE staining.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 let-7a過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠腦組織的保護(hù)作用

2 let-7a過(guò)表達(dá)降低了GFAP表達(dá)水平

由于星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是引起ICH的重要原因之一。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP的表達(dá)水平，以判斷ICH后的繼發(fā)性損傷。結(jié)果顯示，與模型組和NC agomir組相比，let-7a agomir組的GFAP表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而let-7a antagomir組卻明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。這說(shuō)明let-7a過(guò)表達(dá)降低了GFAP的表達(dá)水平。

3 let-7a過(guò)表達(dá)減少神經(jīng)元凋亡

利用TUNEL染色檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡情況；RT-qPCR和Western blot檢測(cè)let-7a表達(dá)水平對(duì)ICH后cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，let-7a antagomir組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；而let-7a agomir組正好相反，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。let-7a antagomir組cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯高于模型組和NC antagomir組（P＜0.05），而let-7a agomir組cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯低于模型組和NC agomir組（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。這些結(jié)果表明，let-7a過(guò)表達(dá)可以減少神經(jīng)元凋亡，使cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平下調(diào)。

Figure 2.let-7a over-expression reduced GFAP expression.A：GFAP mRNA expression level was detected by RT-qPCR；B：GFAP protein expression level was detected by western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.圖2 let-7a過(guò)表達(dá)降低了GFAP的表達(dá)水平

4 let-7a和MAP4K3的靶向關(guān)系

通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan對(duì)let-7a和MAP4K3的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果顯示，MAP4K3 3’-UTR的1056～1068 bp區(qū)域存在has-let-7a-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明MAP4K3是let-7a的靶基因之一，見(jiàn)圖4A。將let-7a mimic和NC mimic轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)顯示，let-7a組中l(wèi)et-7a的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），MAP4K3的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明let-7a過(guò)表達(dá)抑制了MAP4K3的表達(dá)，見(jiàn)圖4B。利用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證let-7a和MAP4K3的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，let-7a mimic組的MAP4K3野生型組螢光素酶活性顯著低于突變型組（P＜0.05），說(shuō)明let-7a和MAP4K3之間的靶向關(guān)系為負(fù)向調(diào)控，見(jiàn)圖4C。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且兩者為負(fù)調(diào)控。

5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

提取腦組織蛋白，利用Western blot檢測(cè)MAP4K3、MKK4和JNK的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，let-7a agomir組中 MAP4K3、p-MKK4/MKK4和 p-JNK/JNK的蛋白水平明顯低于對(duì)照組和NC agomir組；let-7a antagomir組的相關(guān)蛋白水平顯著高于對(duì)照組和NC antagomir組（P＜0.05），見(jiàn)圖5。這說(shuō)明let-7a靶向MAP4K3能夠抑制MKK4/JNK通路的活化。

討 論

miRNA的失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)[6]，在大腦中，miRNA參與控制神經(jīng)元凋亡、程序性細(xì)胞死亡過(guò)程。let-7a是一種腫瘤抑制miRNA，具有調(diào)節(jié)炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞功能[7]，表達(dá)模式在小鼠、大鼠和人類的神經(jīng)分化中比較保守[8]。let-7a在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷中具有保護(hù)作用[9]，可以抑制ICH小鼠促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能[10]。本研究用大鼠ICH模型檢測(cè)了let-7a的表達(dá)水平對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響，結(jié)果顯示let-7a高表達(dá)時(shí)，神經(jīng)功能評(píng)分降低，腦組織病理?yè)p傷減輕。但let-7a表達(dá)水平的調(diào)控在ICH發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。

Figure 3.let-7a over-expression reduced neuronal apoptosis and decreased apoptosis-related protein levels.A：the neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining；B：the apoptosis-related protein levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.圖3 let-7a過(guò)表達(dá)減少神經(jīng)元凋亡并降低凋亡相關(guān)蛋白的水平

Figure 4.Targeting relationship between let-7a and MAP4K3.A：the target gene of let-7a was predicted by TargetScan；B：the expression levels of let-7a and MAP4K3 were detected by RT-qPCR；C：targeting relationship was detected by dual-luciferase reporter assay.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC mimic group.圖4 let-7a和MAP4K3的靶向關(guān)系

Figure 5.let-7a targeted MAP4K3 to inhibit MKK4/JNK pathway activation.The protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

GFAP是一種Ⅲ型中間絲狀蛋白，以單體形式存在，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物。GFAP在大腦發(fā)育、細(xì)胞凋亡和疾病中有著重要的作用[11]，抑制成熟腦的神經(jīng)元增殖和神經(jīng)元突起擴(kuò)展，形成隔離受損組織的物理屏障，促進(jìn)血腦屏障[12]。GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP被認(rèn)為是腦中不良組織反應(yīng)的分子標(biāo)志物和早期指標(biāo)[13-14]，提示凋亡和神經(jīng)炎癥參與延遲血腦屏障和微血管損傷的機(jī)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)改變[15]。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)了let-7a表達(dá)水平對(duì)ICH后GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的影響，并用TUNEL染色檢測(cè)了神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果顯示，let-7a過(guò)表達(dá)降低了GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯減少，這與之前的研究相似[13-15]，說(shuō)明let-7a過(guò)表達(dá)抑制GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的水平，減少神經(jīng)元凋亡。

MAP4K3屬于哺乳動(dòng)物Ste20樣絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，家族成員有MAP4K1/HPK1、MAP4K2/GCK、MAP4K3/GLK、MAP4K4/HGK、MAP4K5/KHS、MAP4K6/MINK 等[16]。MAP4K3在肝癌中參與腫瘤細(xì)胞的存活、凋亡和自噬[17-18]；促進(jìn)胰腺癌[19]、鱗癌[20]和乳腺癌[21]細(xì)胞的凋亡，具有抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，MAP4K3在多系統(tǒng)腦萎縮（multiple system atrophy，MSA）中過(guò)表達(dá)；在黑色素瘤中l(wèi)et-7a通過(guò)下調(diào)MAP4K3抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲性[22]。但在ICH中沒(méi)有被提及和研究。因此，本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)let-7a與MAP4K3的靶向關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)，進(jìn)一步用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了靶向關(guān)系，并將let-7a mimic或NC mimic轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)了MAP4K3和let-7a的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且兩者之間為負(fù)調(diào)控關(guān)系。這與在黑色素瘤中的研究相似[23]，說(shuō)明let-7a通過(guò)下調(diào)MAP4K3來(lái)抑制ICH后神經(jīng)元的凋亡。

JNK參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括凋亡和應(yīng)激反應(yīng)[26]。MKK4控制細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老[25]。研究發(fā)現(xiàn)，MEKK1通過(guò)JNK通路抑制ICH后神經(jīng)元的凋亡[24]。JNK信號(hào)通路在甲狀腺乳頭狀癌中被研究[27]，但在ICH相關(guān)疾病中未被提及或研究。為了解MKK4/JNK信號(hào)通路在ICH中的分子機(jī)制，本研究利用Western blot檢測(cè)了腦組織MAP4K3、MKK4和JNK的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，let-7a過(guò)表達(dá)降低了MAP4K3、MKK4和JNK的表達(dá)。

綜上所述，let-7a通過(guò)抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路減輕ICH大鼠的神經(jīng)元凋亡。這一結(jié)果預(yù)示let-7a有望成為新的ICH治療靶點(diǎn)，但其更為詳細(xì)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。