敲減NLRC3表達對人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞生長的影響*

黃鈾新，孟祥磊，張敏鴻，羅耀玲，李 杰△

（贛南醫學院第一附屬醫院 1核醫學科，2呼吸內科，3臨床科研中心，江西贛州341000）

流行病學調查結果顯示肺癌的發病率和死亡率均位于其它腫瘤之首[1-2]。肺癌的早期臨床表現不典型，早期診斷率較低[1-2]。基因突變是導致肺癌發生的一個重要因素，雖然目前已觀察到諸多生物標志物，如RECQL4（RecQ protein-like 4）、FOXM1（forkhead box M1）等[3-4]與肺癌發病相關，但仍不能滿足臨床上肺癌早期診斷需求，故仍需對肺癌進行探索以尋找肺癌診斷標志物及治療靶點，利于肺癌的早期診斷、早期治療和降低肺癌患者的死亡率。

含胱天蛋白酶募集結構域的NOD樣受體家族蛋白3（NOD-like receptor family caspase recruitment domain containing 3，NLRC3）是NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）家族的一員，由位于16p13.3染色體的NLRC3基因所編碼，是胞質內固有的免疫調節因子，能夠抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）控制的主要炎癥通路[5]。在結腸癌和肝癌中的研究顯示，NLRC3有抑癌作用，是預測和治療腫瘤的潛在腫瘤標志物和新靶點[4-5]。然而NLRC3是否在肺癌發生中起作用，目前尚不清楚。本研究擬通過小片段干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術，敲減NLRC3在人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞內的表達，觀察細胞活力和凋亡的變化，并初步探索NLRC3參與調控肺癌發生的分子機制。

材料和方法

1 材料

BEAS-2B細胞株購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫。RPMI-1640培養液和胎牛血清購自GIBCO；Lipofectamine? 2000和TRIzol購自Invitrogen；熒光定量PCR試劑盒購自BIO-RAD；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；JC-1和annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自BD；β-actin、Bcl-2和Bax抗體及II抗購自中杉金橋公司；3條NLRC3siRNA片段（分別記為siNLRC3-1、siNLRC3-2和siNLRC3-3）及陰性對照序列（negative control siRNA，siNC）由生工生物（上海）股份有限公司設計合成。

2 方法

2.1 細胞培養 BEAS-2B細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液；于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫細胞培養箱中培養。細胞表現為貼壁生長，后續實驗所用細胞均是取自處于對數生長期的細胞，活細胞數達95%以上。

2.2 BEAS-2B細胞的siRNA轉染及最佳干擾片段的篩選 按照Lipofectamine?2000轉染操作說明書將熒光標記的FAM-siRNA片段按照不同比例轉染于6孔板中BEAS-2B細胞，轉染6 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

為篩選最佳干擾片段，將細胞分為未轉染（untransfected，UT）組、siNC組、siNLRC3-1組、siNLRC3-2組和siNLRC3-3組。各實驗組均取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，計數，按每孔1.5×105個細胞接種于6孔板，待細胞密度達30%～50%后開始轉染。轉染6 h后將培養液更換為完全培養液繼續培養24 h。收集各組細胞，采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，并通過紫外分光光度儀測定濃度及純度。

將各組總RNA濃度調一致后，按照TaKaRa的PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉錄試劑盒說明書的指導進行cDNA逆轉錄反應操作，熒光定量PCR驗證3條干擾片段的干擾效果，挑選最佳干擾片段。NLRC3的上游引物序列為5'-GACATGAAGGCGTTTGGTGT-3'，下游引物序列為5'-GCCATAGTAATACGCGGCTG-3'，產物長度為153 bp。內參照β-actin的上游引物序列為5'-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3'，下游引物序列為5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，產物長度為 320 bp。PCR條件為：94℃預變性10 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s并收集熒光，共40個循環。數據采用相對定量法，以 2-ΔΔCt來進行分析，ΔCt=Ct目的-Ct內參照，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

2.3 MTT法檢測3個干擾片段對BEAS-2B細胞的活力影響 胰酶消化對數生長期的BEAS-2B細胞，計數并按每孔4×103個來接種96孔培養板，待過夜培養貼壁后以siNLRC3∶Lipofectamine?2000為0.25 μL∶0.25 μL的量進行細胞轉染，UT組用PBS處理，轉染6 h后更換新的培養液繼續培養24 h，然后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續培養4 h，培養結束后小心吸去孔內液體，然后每孔加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min使結晶物充分融解，隨后用酶標儀于570 nm波長測定各孔吸光度（A570）。實驗重復3次。細胞相對活力（%）=干擾組A570/UT組A570×100%。

2.4 JC-1檢測線粒體膜電位 將細胞分為3組：UT組、siNC組和siNLRC3-3組。取對數生長期的BEAS-2B細胞，按每孔1.5×105接種于6孔板，待細胞密度達50%后開始轉染，轉染6 h后更換培養液繼續培養24 h。然后收集各組的細胞，計數；再用PBS洗滌2次，重懸，調節細胞濃度為1×109L。從中取細胞懸液100 mg/L加入流式管，加入終濃度為10 mg/L的JC-1，37℃溫育30 min，然后上流式細胞儀進行檢測。

2.5 annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率 實驗分組、細胞培養及轉染方法同前JC-1實驗。收集轉染24 h后的各轉染組細胞及未轉染組細胞，冷PBS洗滌2次，4℃、192×g離心 5 min，用 1×Binding Buffer調整濃度1×109/L；從中取細胞懸液100 μL（1×105個細胞）加入流式管，并向管中加入5 μL annexin V-FITC，輕輕搖勻后避光室溫孵育10 min，再于管中加入5 μL PI，室溫下避光孵育15 min；孵育結束后向管內添加400 μL 1×Binding Buffer，輕輕搖勻后1 h內用流式細胞儀進行檢測。計算凋亡細胞占總細胞的百分比。

2.6 Western blot檢測敲減NLRC3表達對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 實驗分組、細胞培養及轉染方法同前，轉染48 h后棄培養液并用1×PBS洗滌3遍，隨后置冰上用RIPA裂解液（用前加入PMSF，終濃度為1 mmol/L）充分裂解各組細胞30 min，繼之以4℃、16 400×g離心5 min，上清液即是總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白量；每組蛋白上樣30 μg；SDS-PAGE分離蛋白后切取目的蛋白凝膠進行電轉PVDF膜；后經封閉、I抗孵育、洗膜、II抗孵育、洗膜、ECL發光等步驟，在Bio-Rad凝膠成像儀上成像，并將條帶進行灰度分析。

3 統計學處理

運用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析，結果以均數±標準差（mean±SD）表示；多組數據間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 熒光顯微鏡觀察轉染效率

FAM-siNC轉染6 h后，于熒光顯微鏡下觀察發現，轉染比例100 pmol∶5 μL組發出綠色熒光的細胞約占觀察視野下細胞總數的90%以上，且細胞生長狀態良好，見圖1。

Figure 1.The transfection efficiency（6 h after FAM-siNC transfection）observed under fluorescence inverted microscope（scale bar=100 μm）.A：bright field image；B：fluorescence field image.After transfection，the cells grew well with normal shape，and 90 percentage of the cells were stained.圖1 FAM-siNC轉染6 h后觀察轉染效果

2 RT-qPCR篩選干擾片段

RT-qPCR結果顯示，UT組、siNC組和siNLRC3-2組NLRC3 mRNA的表達水平無顯著差異（P＞0.05）；siNLRC3-1組NLRC3 mRNA的表達水平顯著低于 UT組（P＜0.05）；與UT組比較，siNLRC3-3組NLRC3 mRNA 的表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Comparison of the interference effects of the 3 interference segments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs UT group.圖2 3個干擾片段干擾效果的比較

3 MTT法檢測敲減NLRC3對BEAS-2B細胞活力的影響

MTT法檢測3個干擾片段轉染后各組細胞的活力，進一步驗證干擾片段的干擾效果。結果顯示，與UT組相比，siNC組和siNLRC3-2組細胞活力無顯著差異（P＞0.05）；siNLRC3-1組和siNLRC3-3組細胞活力與UT組相比顯著增強（P＜0.05），見圖3。結合RT-qPCR篩選結果和MTT結果，我們認為siNLRC3-3片段具有較好的干擾效果，可用于后續實驗。

Figure 3.The effect of NLRC3 knock-down on viability of BEAS-2B cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs UT group.圖3 敲減NLRC3基因對BEAS-2B細胞活力的影響

4 敲減NLRC3對BEAS-2B細胞線粒體膜電位的影響

采用JC-1熒光探針和流式細胞術檢測線粒體膜電位，R2門代表正常細胞，R3門代表凋亡細胞，R2/R3比值增加表示線粒體膜電位升高，早期細胞凋亡減少。結果顯示，siNLRC3-3組的R2/R3與UT組和siNC組相比顯著增加（P＜0.05），見圖4及表1。

Figure 4.The mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry with JC-1 staining.圖4 JC-1和流式細胞術檢測線粒體膜電位

表1 線粒體膜電位變化的比較Table 1.Comparison ofmitochondrialmembrane potential changes（n=3）

5 敲減NLRC3對BEAS-2B細胞凋亡的影響

采用annexin V/PI染色和流式細胞術檢測檢測細胞凋亡，結果顯示，siNLRC3-3組凋亡率與UT組和siNC組相比顯著下降（P＜0.05），而siNC組和UT組的細胞凋亡率相比無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

6 Western blot檢測敲減NLRC3對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與UT組和siNC組相比，siNLRC3-3組中Bcl-2蛋白表達水平顯著上調，而Bax蛋白表達水平顯著下調（P＜0.01），見圖6。

Figure 5.The effect of NLRC3 knock-down on apoptosis of BEAS-2B cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs UT group.圖5 敲減NLRC3對BEAS-2B細胞凋亡的影響

Figure 6.The effect of NLRC3 knock-down on the protein expression levels of Bcl-2 and Bax.Mean±SD.n=3.#P＜0.01 vs UT group.圖6 敲減NLRC3對Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響

討 論

NLRC3又稱NOD3、CLR16.2，屬于NLRs家族成員[6-8]，在結直腸癌和肝細胞癌組織中顯著低表達[9-10]。已有研究表明，NLRC3在調節免疫、抗炎、調節細胞增殖和凋亡等病理生理過程中起重要作用[7，11-14]。

本研究探索了NLRC3在肺癌發生中的作用。MTT檢測結果表明，敲減NLRC3后BEAS-2B細胞活力顯著增強，與Ma等[10]和Zha等[14]所觀察到的低表達NLRC3對細胞增殖影響的結果相一致。腫瘤的特征之一是增殖能力增強[15-16]，因此我們推測NLRC3低表達可能是導致肺癌發生的一個關鍵因素。同時細胞凋亡檢測結果表明，NLRC3低表達后線粒體膜電位顯著升高，晚期凋亡細胞數減少。線粒體跨膜電位下降是內源性細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件[17-18]。脂質熒光探針JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。JC-1在線粒體膜電位較高時為聚合物，產生紅色熒光；在膜電位較低時為單體，產生綠色熒光[19-20]。通過JC-1熒光顏色的轉變很容易地檢測到線粒體膜電位的變化。根據本實驗結果結合既往研究推測NLRC3可通過內源性線粒體凋亡途徑調節BEAS-2B細胞凋亡/增殖平衡，當NLRC3低表達后其在細胞凋亡信號網絡中的調節作用減弱，最終導致凋亡/增殖失衡。既往研究表明，NLRC3在調節細胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程中起一定的作用，我們觀察到在BEAS-2B細胞中敲減NLRC3可導致細胞活力、凋亡等細胞生物學行為發生改變，提示NLRC3低表達可能在肺癌起始過程中發揮作用，但相關機制仍需進一步研究。

基因表達異常引起腫瘤發生往往涉及到凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達改變，因此我們進一步在蛋白分子水平探索NLRC3低表達后引起凋亡/增殖失衡的機制，Western blot結果顯示，敲減NLRC3后Bcl-2蛋白表達上調，而Bax蛋白表達下調。Rezaei等[21]的研究顯示，抑制Bcl-2蛋白表達并過表達Bax蛋白，上調Bax/Bcl-2比例，能夠誘導HepG2和L929細胞凋亡。Bcl-2蛋白家族是線粒體膜蛋白，其中Bcl-2蛋白是重要的抗調亡蛋白[22]，而Bax蛋白是重要的促凋亡蛋白[23]，Bcl-2/Bax被認為是啟動細胞凋亡的分子開關[24-26]，參與內源性線粒體凋亡信號通路的調控。內源性線粒體凋亡信號通路活化可引起線粒體因子（如細胞色素C）釋放，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease-activating factor 1，APAF-1）、caspases-9形成凋亡小體并被活化，最終啟動細胞凋亡，參與并維持細胞凋亡與增殖平衡。由此可推測，Bcl-2和Bax蛋白可能是NLRC3的調節靶點，影響凋亡相關因子Bcl-2和Bax的表達可能是低表達NLRC3影響BEAS-2B細胞生長、增殖、凋亡等細胞生物學行為的方式之一。

本研究表明，敲減NLRC3表達能夠對Bcl-2和Bax蛋白的表達水平產生影響，但我們仍然不清楚NLRC3是通過直接還是間接的作用方式影響Bcl-2和Bax蛋白表達及與它們相互作用的方式。此外，由于信號網絡的復雜性，其中所涉及的作用機制及信號通路也不清楚。

綜上所述，本研究證實了敲減NLRC3表達可抑制BEAS-2B細胞凋亡，增強細胞活力。本研究揭示了NLRC3低表達可能是引起肺癌發生的一個關鍵因素，同時也提示NLRC3低表達可能是肺癌的潛在腫瘤標志物和潛在治療靶點。但由于實驗的局限性，探索還不夠十分深入和廣泛，需要后期從蛋白質組學、動物體內實驗和臨床水平實驗進一步探索。