安徽省非結核分枝桿菌臨床分離率及人群分布和耐藥性分析

包訓迪 江躍 梁鎖 程紅燕 夏廣秀 王超 葉倩 王舒 王慶

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除了結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外的分枝桿菌，在自然界中廣泛分布，已知的NTM數量可達190余種[1]。人和動物均可感染NTM，主要引起肺部和皮膚病變等，臨床表現與肺結核相似，而且傳統的痰涂片、痰培養均不能與結核分枝桿菌相鑒別，導致NTM感染常被誤診為結核病或耐藥結核病，引起治療不當，病情延誤，嚴重影響患者的預后[2]。隨著近年來NTM菌株分離率的增高，其危害性也越來越受到大家的重視[3]。筆者對安徽省2015—2016年度結核病耐藥性基線調查收集的菌株進行分離鑒定，初步了解安徽省NTM臨床分離株在不同人群中的分布特征及其耐藥性，為我省NTM的防治提供有效參考。

材料和方法

1.研究材料：參照《WHO耐藥監測指南(第4版)》[4]按照分層整群抽樣的方法，在全省86個結核病門診抽取42個調查點，連續納入2015年9月15日至2016年8月31日的涂陽疑似肺結核患者3047例，按照文獻[5]進行痰標本酸性羅氏培養，對獲得的2652株培養陽性菌株行菌種鑒定[對硝基苯甲酸(PNB)培養和早期分泌蛋白(MPB64)膠體金法]和基因測序(16S rRNA和hsp65 DNA測序)，再對其中的NTM臨床分離株在不同人群中的分布特征和耐藥性檢測(微孔板法)進行研究和分析。

2.試劑和儀器：(1)羅氏培養基(L-J)、PNB (500 mg/L)培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司；結核分枝桿菌復合群特異性早期分泌蛋白(MPB64)檢測試劑盒(膠體金法)購自杭州創新生物檢控技術有限公司；分枝桿菌菌種鑒定采用16S rRNA 和hsp65兩個同源序列分析同源DNA序列組成差異鑒定細菌至種水平，引物合成及測序測定由上海生工生物工程有限公司完成；NTM藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測試劑盒(微孔板法)由珠海銀科醫學工程股份有限公司提供(含15種藥品)。(2)BACspreaderTM1100c細菌超聲分散計數儀由廣東體必康生物科技有限公司提供；YK-909分枝桿菌微孔板藥敏讀儀、YK-96小型全自動移液平臺均由珠海銀科醫學工程股份有限公司提供。

3.菌種鑒定方法：(1)按照試劑盒說明書和結核病實驗室檢驗規程進行操作，應用MPB64抗原和PNB鑒別培養基對培養陽性菌株進行初步鑒定。當PNB培養基有細菌生長或MPB64抗原檢測呈陰性則初步鑒定為NTM。(2)挑取初步鑒定為NTM的菌株接種環一環，加入100 μl純水，渦旋振蕩重懸。95 ℃金屬浴孵育30 min，37 kHz 80 W超聲裂解15 min；離心半徑8.2 cm，12 000 r/min 離心5 min，上清液即為DNA。(3)NTM菌種鑒定的DNA引物采用16S rRNA和hsp65兩個同源序列，分析鑒定細菌至種水平。將16S rRNA和hsp65測序序列提交NCBI網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比較。依據鑒定菌種的DNA序列與參照菌種的同源性≥97%[6]來確定菌種。

4. NTM的藥敏試驗：采用液基微孔板法[7]對選取的對數生長期培養陽性的菌株進行15種藥品的NTM藥敏試驗，應用細菌超聲分散計數儀進行細菌的超聲比濁定量，按照NTM藥敏檢測試劑盒(微孔板法)說明書進行操作判讀。不同藥品的最低抑菌濃度(MIC)判讀耐藥的標準為：利福平：≥6 μg/ml；克拉霉素：≥16 μg/ml；亞胺培南-西司他丁：≥16 μg/ml；阿奇霉素：≥16 μg/ml；利奈唑胺：≥32 μg/ml；阿米卡星：≥64 μg/ml；乙胺丁醇：≥2.5 μg/ml；利福布汀：≥2 μg/ml；頭孢西丁：≥80 μg/ml；妥布霉素：≥16 μg/ml；莫西沙星：≥8 μg/ml；加替沙星：≥1 μg/ml；多西環素：≥8 μg/ml；米諾環素：≥8 μg/ml；磺胺甲唑：≥80 μg/ml。

5.統計學處理：采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計學分析。計數資料的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1. 菌種鑒定及流行病學分布特征：對2652株培養陽性菌株采用PNB培養和MPB64膠體金法行初步菌種鑒定，結果顯示：2530株為結核分枝桿菌復合群，122株為NTM，其中115株菌株在PNB培養基上生長，116株菌株MPB64抗原檢測呈陰性(表1)；進一步對122株NTM菌株進行基因測序(16S rRNA和hsp65 DNA測序)，最終鑒定為NTM分離株107株[符合率為87.70%(107/122)]、結核分枝桿菌12株、諾卡菌1株、污染菌2株，NTM分離率為4.03%。不同臨床特征人群結核分枝桿菌和NTM菌株的分布情況見表2。

表1 MPB64抗原和PNB培養對NTM的檢測結果(株)

表2 不同臨床特征研究對象的結核分枝桿菌和NTM菌株分離情況

續表2

注分離率=NTM菌株數/培陽菌株數×100%；統計學檢驗為NTM分離率在不同特征研究對象中的差異。a:指除農民、工人、退休、待崗以外的人員，如事業單位員工、商業人員等；b：安徽省地區行政區域分布以長江和淮河為界，劃分為皖北、皖中和皖南三個地區

2.NTM菌種特征序列比對結果：107株NTM經菌種鑒定共計分離出6種優勢流行菌種(表3)。

表3 基因測序鑒定的NTM菌種結果

3. NTM藥敏試驗檢測：對107株NTM菌株進行藥敏試驗，106株獲得藥敏試驗結果，1例胞內分枝桿菌菌株復蘇失敗未獲得菌株。除外草分枝桿菌和馬賽分枝桿菌各1株，僅統計其他4種104株NTM的藥敏試驗結果。結果顯示不同NTM對阿米卡星、利福布汀、克拉霉素和利福平的敏感度較高[分別為87.50%(91/104)、86.54%(90/104)、83.65%(87/104)、75.00%(78/104)]，對亞胺培南/西司他丁、頭孢西丁、米諾環素、多西環素等的耐藥率較高[分別為100.00%(104/104)、95.19%(99/104)、94.23%(98/104)、93.27%(97/104)](表4)。

討 論

近些年，隨著各種新診斷技術在結核病檢測中的推廣和應用，NTM的分離率呈現逐年增高的趨勢，國內外關于NTM及NTM肺病報道和研究也越來越多。NTM肺病的臨床癥狀與肺結核非常相似，極易發生誤診；又因其對傳統的抗結核藥品耐藥率較高，如錯誤使用抗結核藥品治療，則效果多不理想[8-9]，易被誤診為耐藥結核分枝桿菌感染，給臨床診治帶來很大困惑。因此，NTM的鑒定和耐藥性檢測將會為區分結核分枝桿菌和NTM的鑒別診斷和治療提供有力保證。

表4 不同藥品在104株不同NTM中的耐藥情況[株(耐藥率，%)]

我國2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查[10]結果顯示，NTM的分離率從1990年的4.9%升高至2000年的11.1%，繼而升高至2010年的22.9%，說明我國的NTM病疫情呈明顯上升態勢。本研究對2652株分枝桿菌菌株，經PNB和MPB64抗原初步鑒定分離出NTM菌株122株，經基因測序方法最終確認107株為NTM，檢出率為4.03%，遠低于22.9%的全國平均水平，可能是本次納入的患者僅為涂陽患者，而未納入癥狀較輕或涂陰疑似患者，從而導致NTM的檢出率低于實際發病率。另外，我省NTM的檢出率也低于多數沿海省份的分離率(10.20%～15.13%)[11-13]，但與周邊河南(2.9%，5/171)[14]、江蘇地區(3.37%)[15]的NTM分離率基本接近，可能與NTM的地域和地形分布有關。近年來的一些文獻報道認為，NTM分離率呈現沿海高于內地、南方高于北方的地區流行特點[16]，提示NTM分布受地區影響；安徽省地處江淮平原，長江以北多為平原地區，長江以南為丘陵地區，平原地區人口眾多，結核病患者數量也較多[17]，本研究皖北皖中地區的NTM檢出率高于皖南地區，與本地區結核病的發病情況基本一致。

在不同特征人群中，NTM的檢出率也有差異。有研究指出，在60歲以上人群中分離出NTM較多，可能與該人群免疫力降低有關，也可能與疾病的相關性下降(即感染NTM并不一定發生NTM病)考慮呼吸道NTM定植有關[18]。本次調查發現，NTM的分離率在60歲及以上、農民、低收入、低文化程度人群中的檢出率較高，這與本地區結核病患者的發病人群比例[10]也基本一致，提示在上述分類人群中，結核病和NTM病的患病率均較高，在診治過程中應重視兩病的鑒別。本研究還發現，復治患者的NTM分離率明顯高于初治患者，但目前尚未發現其他相關研究，可能與復治結核病患者更關注呼吸系統疾病，就醫意愿及頻率更高有關；女性NTM病患者的檢出率明顯高于男性，與Cassidy等[19]的研究結果基本一致，可能與女性壽命更長、身體免疫力較弱、就醫意愿更強等有關，提示應重視我省復治、女性結核病患者NTM的鑒定，以避免誤診。

不同地區的NTM感染種群類型存在地區差異。有研究顯示，廣東地區的NTM優勢菌為龜膿腫分枝桿菌、鳥-胞內分枝桿菌復合群[20]，而上海地區優勢流行菌種為龜分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌[21]。本研究107株NTM分離株中，胞內分枝桿菌占比最高，與Pang等[22]多中心研究基本一致，說明胞內分枝桿菌在我國可能是優勢NTM菌株[23-26]；其次為膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌，草分枝桿菌和馬賽分枝桿菌各分離出1株，與上述研究的NTM分布有較大差距，說明不同的NTM在不同的生長環境下有其不同的生長特性，本研究NTM分布及耐藥性結果可為本省NTM的流行趨勢提供參考。

既往研究證明，NTM對大多數的抗生素基本耐藥[27]，耐藥率較高。本研究根據CLSI M24-A第三版標準[28]，對獲得的107株NTM分離株采用液基微孔板法檢測了不同NTM對15種抗生素的耐藥性。結果顯示，胞內和鳥分枝桿菌對于抗生素的耐藥率要高于膿腫分枝桿菌，其中胞內分枝桿菌對米諾環素、磺胺甲唑、多西環素、頭孢西丁、阿奇霉素等抗生素的耐藥率均達到90%以上；膿腫分枝桿菌對乙胺丁醇、加替沙星、多西環素、米諾環素、磺胺甲唑等抗生素的耐藥率也達到了80%以上；而不同分枝桿菌對亞胺培南/西司他丁的耐藥率均高達100.00%。另外，胞內和鳥分枝桿菌對阿米卡星和克拉霉素的敏感性均較高，與曹楊榮[29]的研究認為阿米卡星和克拉霉素的聯合應用對NTM的治療效果較好的結論基本一致；提示對我省NTM感染患者在沒有藥敏試驗結果而需要進行臨床治療時，可優先使用這些抗生素進行治療。目前，關于NTM的藥敏試驗研究主要集中于對抗結核藥品的耐藥性分析，而NTM對于抗結核藥品的耐藥率普遍較高[27,30]，研究意義不大。也說明對NTM應選擇合適的治療藥品進行藥敏試驗，對抗結核藥品的藥敏試驗并不適用于NTM。

目前，基層實驗室的NTM鑒定主要依靠傳統分離培養和菌種鑒定技術，耗時較長，且方法較為繁瑣，現有的一些分子生物學方法可以快速鑒別，但設備昂貴，對實驗室及檢驗人員要求較高，在基層開展較為困難。本研究結合傳統的病原學和免疫學方法(PNB和MPB64抗原聯合檢測)，從2652株培養陽性分枝桿菌菌株中初步篩選出122株NTM菌株，再經16S rRNA和hsp65兩個引物進行擴增測序，最終獲得107株NTM菌株，符合率為87.70%，與其他研究基本一致[31-32]。說明在基層實驗室，如果受條件限制，不能開展分子生物學檢測，可以先開展較為簡便且易操作的病原學和免疫學方法檢測，如果初篩檢測出NTM感染，可以先考慮按照NTM標準診療方案進行治療，再將標本送至有檢測能力的實驗室，根據分子生物學方法鑒定和藥敏試驗結果調整治療方案，這樣可大大優化診治流程，縮短診療時間，為患者的診斷和治療提供方便。此外，微孔板法藥敏試驗是近年發展出來的檢測技術，需要加強質量控制工作。本研究的藥敏試驗檢測過程中，參加了中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室的藥敏室間質量控制項目，取得了優秀成績；但此次質量控制覆蓋的藥品種類較少，主要是常見的抗結核藥品，對于NTM藥敏試驗檢測的質量控制較少，期望未來將NTM藥敏試驗檢測室間質量控制作為重點發展方向。

本研究是安徽省第一次進行系統性的NTM監測分析，由于條件限制，在患者納入、菌種鑒定方法的選擇上存在一定的局限，可能會導致NTM分離率存在一定的誤差。但筆者認為研究結果仍可為安徽省NTM的病原譜和耐藥性提供初步的基線數據，為以后的持續性監測提供參考。隨著各種檢測技術的不斷更新發展，鑒定出的NTM菌種也會不斷增多，可能會對NTM病的臨床診斷造成一定干擾。因此，提升實驗室的鑒別診斷水平，監測分析NTM的流行病學特征、菌種特性和耐藥性，以便為NTM病的早期診斷和治療提供依據。