急性呼吸窘迫綜合征患者香葉基香葉基焦磷酸合成酶的表達及其臨床意義

王曉霞，許天祥，呂鏜烽，胥武劍，劉建波，宋 勇

1.內蒙古自治區人民醫院重癥醫學科，呼和浩特010017；2.內蒙古自治區人民醫院腹部腫瘤外科，呼和浩特010017；3.東部戰區總醫院呼吸與危重癥醫學科，南京 210002

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是感染、創傷、失血、休克、誤吸等多種病因引起的炎癥反應失控而導致以肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞彌漫性損傷為主要病理改變的臨床綜合征，其病死率高達30%～50%[1-2]，嚴重威脅人類的健康。目前，臨床上對ARDS 患者的診斷主要依靠臨床標準，缺乏高特異度和敏感度可以反映ARDS 病情嚴重程度和預后情況的生物標志物，給ARDS 臨床診治帶來巨大的困難。因此，尋找新的指標判斷ARDS 患者預后至關重要[3]。研究[4-7]表明，某些生物標志物在評估ARDS 高風險人群、臨床療效、疾病預后、臨床試驗項目優化方面起到一定作用，甚至有利于促進臨床上開展有針對性治療方法的研究。香葉基香葉基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）是甲羥戊酸代謝途徑中重要的分支酶，催化法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）合成香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），FPP 與GGPP 參與蛋白的異戊二烯化修飾[8]。這些蛋白只有發生異戊二烯化修飾后才能定位到細胞膜上，促發下游信號通路的激活，廣泛參與細胞的生理、病理生理過程。GGPPS 表達異常會引起FPP 與GGPP 表達失衡，導致許多疾病的發生[9]，包括炎癥性疾病，如吸煙誘導的肺部炎癥性疾病[10]、睪丸支持細胞的炎癥反應[11]等。筆者前期研究[12]用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠肺損傷模型，小鼠肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞中的GGPPS 表達升高，并參與肺部炎癥反應，推測GGPPS有望作為ARDS 治療的作用靶點。但目前尚缺乏關于GGPPS 在ARDS 診治中臨床意義的相關研究。因此，本研究通過檢測ARDS 患者及正常體檢人群外周血單個核細胞中GGPPS 的表達情況，對GGPPS 在ARDS 診治中的臨床意義進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

根據柏林診斷標準[13]，將ARDS 患者分為輕度、中度、重度。輕度：呼吸末正壓（positive end expiratory pressure，PEEP）或持續氣道正壓（continuous positive airway pressure，CPAP）≥5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa） 時，200 mmHg＜氧合指數（PaO2/FiO2）≤300 mmHg（1 mmHg= 0.133 kPa）。 中 度：PEEP ≥5 cmH2O 時，100 mmHg＜PaO2/FiO2≤ 200 mmHg。重 度：PEEP ≥ 5 cmH2O 時，PaO2/FiO2≤ 100 mmHg。

1.2 納入及排除標準

納入標準：年齡≥18 歲；符合柏林診斷標準；住院后測得PaO2/FiO2當日入組。排除標準：①發病時間超過24 h，臨床診斷不明確者。②免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病、肺間質性疾病及近期使用免疫抑制劑治療者。③孕婦及合并惡性腫瘤患者。④拒絕提供外周血及拒絕機械通氣的患者。

1.3 研究對象及分組

收集2015 年3 月—2018 年3 月于內蒙古自治區人民醫院重癥醫學科（intensive care unit，ICU）住院的60例符合上述診斷標準的ARDS 患者；男性35 例，女性25 例，年齡（60.03±13.09）歲。同時收集60 例門診正常體檢人群（對照組）；男性33 例，女性27 例，年齡（58.45±7.15）歲。2 組間年齡、性別構成的差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者均于確診24 h 內采集動、靜脈血進行血氣分析、血常規及實驗室檢查。對照組采集清晨空腹靜脈血，用于實驗室檢查。ARDS 患者中，輕度ARDS 32 例、中度ARDS 17 例、重度ARDS 11 例。存活組40 例，死亡組20 例；死亡組中，輕度ARDS 1 例、中度ARDS 8 例、重度ARDS 11 例。本研究通過內蒙古自治區人民醫院醫學倫理委員會批準，研究對象或其家屬簽署知情同意書。

1.4 疾病嚴重程度評估

應用急性生理與慢性健康評分Ⅱ（ acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）、序貫器官功能衰竭估計（ sequential organ failure assessment，SOFA）評分、PaO2/FiO2及柏林診斷標準[13]進行疾病嚴重程度評估，在診斷后24 h 內完成。

1.5 主要試劑及儀器

人外周血單個核細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），TRIzol 試劑（15596-018，Invitrogen），反轉錄試劑盒（RR036A，TaKaRa），real-time PCR 試劑盒（RR420A，TaKaRa），real-time PCR 引物（南京Realgene 生物技術有限公司合成），BCA 蛋白定量試劑盒（KGP904，江蘇凱基生物技術股份有限公司），SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），兔抗β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體（2128，CST，1:1 000 稀釋），鼠 抗GGPPS 單 克 隆 抗 體（sc-271680，Santa Cruz Biotechnology，1:500 稀釋），辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（ab6721，Abcam，1:10 000 稀釋），HRP 標記山羊抗鼠IgG（ab6789，Abcam，1:10 000 稀釋）。蛋白電泳轉移儀（Bio-Rad），real-time 定量PCR 儀（Eppendorf）。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 人外周血單個核細胞分離 采集ARDS 患者和對照組人群的外周靜脈血 4 ～5 mL 于EDTA 抗凝管，與全血稀釋液1:1 混勻后緩慢加于1 份人外周血單個核細胞分離液的液面之上，以1 500 r/min（半徑為10 cm 水平轉子）離心15 min；此時，離心管中由上至下細胞分4 層，第1 層為血漿層，第2 層為環狀乳白色的單個核細胞層，第3 層為分離液層，第4 層為紅細胞層；用吸管小心吸取第2 層環狀乳白色單個核細胞層到另一支15 mL 離心管中，按照說明書清洗離心，即得所需的單個核細胞，用于提取RNA 及蛋白。

1.6.2 定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reversetranscription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 表達 ①提取外周血分離的單個核細胞的總RNA。②將總RNA 反轉錄合成 cDNA。③以cDNA 為模板，以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因為內參基因，利用GGPPS 和GAPDH 特異性引物（表1），采用SYBR Green qRT-PCR 檢測GGPPS 和GAPDH 的表達水平。反應結束后，根據定量PCR 所得出的GGPPS 和GAPDH 的CT值，應用2-ΔΔCT方法計算GGPPS mRNA 相對表達量。

表1 GGPPS 和GAPDH 的PCR 引物Tab 1 PCR primers of GGPPS and GAPDH

1.6.3 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測單個核細胞中GGPPS 蛋白表達 ①提取外周血分離的單個核細胞的總蛋白。②BCA 法蛋白定量。③在加樣孔中加入2 ～5 μL標準蛋白及蛋白樣品（30 ～50 μg），根據測得的蛋白濃度計算蛋白樣品加樣體積。④先以電壓80 V 恒壓處理30 ～45 min，使蛋白樣品經濃縮膠壓縮，待樣品徹底進入分離膠后切換電壓，使其升至110 ～120 V 繼續電泳將蛋白分離。⑤恒流，200 mA 轉移至PVDF 膜。⑥封閉過夜。⑦分別加入一抗4 ℃孵育12 h，TBST 充分洗膜后再分別與二抗室溫孵育1 h。⑧TBST 充分洗膜，進行ECL 化學發光顯色。曝光后掃描，分別以GGPPS/β-tubulin 顯影條帶灰度值的比值表示GGPPS 蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 5 軟件作圖。定量資料以±s 表示。2 組間均數的比較采用獨立樣本t 檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間比較前行方差齊性檢驗。定性資料以頻數和百分比表示，比較采用χ2檢驗。GGPPS 表達與ARDS 患者臨床指標的相關性采用Spearman 相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 存活組與死亡組患者臨床資料比較

存活組及死亡組患者臨床資料對比分析見表2。2 組患者的年齡、性別、白細胞（white blood cell，WBC）計數、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、ICU 住院時間及ARDS 的病因構成比的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。死亡組患者血肌酐（creatinine，Cr）、谷丙轉氨酶（glutamatepyruvate transaminase，GPT）、 谷 草 轉 氨 酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT）、APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、機械通氣（mechanical ventilation，MV）時間高于存活組，死亡組PaO2/FiO2低于存活組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 存活組與死亡組ARDS 患者臨床資料比較Tab 2 Comparison of clinical data between survivors and non-survivors in ARDS patients

Continued Tab

2.2 ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 表達水平

ARDS 組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 相對表達量（3.994±1.325）明顯高于對照組（P=0.000）（圖1）。ARDS 重度組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 相對表達量（5.774±0.573）明顯高于輕度組（3.215±0.958）和中度組（4.365±0.837），中度組明顯高于輕度組，差異均有統計學意義（均P=0.000）（圖2）。

圖1 ARDS組與對照組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA表達水平比較（n=60）Fig 1 Expression levels of GGPPS mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with ARDS and healthy controls (n=60)

圖2 不同程度ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 表達水平比較Fig 2 Expression levels of GGPPS mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with different degrees of ARDS

2.3 ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS 蛋白表達水平

ARDS 組外周血單個核細胞中GGPPS 蛋白表達水平明顯高于對照組，重度組明顯高于輕度及中度組，中度組明顯高于輕度組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同程度ARDS 組和對照組患者外周血單個核細胞中GGPPS 蛋白表達水平Fig 3 Protein expression levels of GGPPS in peripheral blood mononuclear cells of patients with different degrees of ARDS and healthy controls

2.4 ARDS 死亡組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 及蛋白表達

ARDS 死亡組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 相對表達量（5.178±0.675）明顯高于存活組（3.401±1.163），差異有統計學意義（P=0.000）（圖4）；ARDS 死亡組外周血單個核細胞中GGPPS 蛋白表達水平明顯高于存活組（P＜0.05）（圖5）。

圖4 ARDS 存活組與死亡組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 表達的比較Fig 4 Expression levels of GGPPS mRNA in peripheral blood mononuclear cells of survivors and non-survivors

圖5 ARDS 存活組和死亡組外周血單個核細胞中 GGPPS 蛋白表達Fig 5 Protein expression levels of GGPPS in peripheral blood mononuclear cells of survivors and non-survivors

2.5 ARDS 患者中GGPPS 升高與臨床指標的關系

ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 的高表達與高的APACHE Ⅱ評分（r=0.862，P=0.000）、高SOFA 評分（r=0.719，P=0.023）、低氧合指數（r=-0.821， P=0.000）、高C 反應蛋白（r=0.758，P=0.024）及高白細胞計數（r=0.761，P=0.015）相關（表3）。

表3 ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 表達與臨床指標的相關性分析（n=60）Tab 3 Correlation analysis of GGPPS mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells and clinical indicators of ARDS patients (n=60)

3 討論

ARDS 是ICU 常見危重病，盡管目前在臨床治療上取得了很多進展，但病死率仍居高不下[2]。早期預測 ARDS 患者病情嚴重程度及預后，探索可行的藥物治療靶點，對改善患者的預后及降低病死率具有重要的意義。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl -coenzyme A，HMG-CoA）還原酶特異性抑制劑，作用于甲羥戊酸代謝途徑的上游，廣泛用于治療高脂血癥。有研究[14-16]顯示，他汀類藥物通過抑制甲羥戊酸代謝途徑抑制LPS 誘導的肺損傷炎癥反應。但是，2 項大型的Ⅲ期隨機對照臨床研究顯示，辛伐他汀和洛伐他汀不能降低ARDS 患者的病死率和縮短機械通氣時間[17-18]。這2 項研究的結果，不僅與ARDS 患者的異質性過大有關，也可能因為即使給予高劑量藥物也難以達到有效的血藥濃度及組織濃度[19-20]，還有可能與他汀類藥物的作用靶點處于上游，其阻斷后不良反應過大而限制了藥物的治療作用有關[16]。因此，在甲羥戊酸代謝途徑下游找到更具特異性的炎癥相關分子，可能可以更有針對性地對ARDS 患者進行治療。GGPPS 作為甲羥戊酸代謝途徑下游關鍵的代謝產物，通過調控FPP/GGPP 的平衡在許多疾病中發揮重要作用。研究[10]顯示，在慢性香煙煙霧暴露誘導的肺部炎癥中GGPPS 表達升高，下調肺組織 GGPPS表達后，促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/胞外信號調節激酶（extracellular regulated kinases，ERK） 活化水平降低，肺組織白細胞介素-8 （interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達降低，提示GGPPS 表達下調抑制了炎癥的發展，推測GGPPS 在肺部炎癥中可能發揮作用。本研究組前期研究[12]發現，在LPS 誘導的小鼠急性肺損傷模型的肺組織中GGPPS 表達升高，特異性敲除小鼠肺泡上皮細胞中的Ggpps 可抑制LPS 誘導的急性肺損傷的肺泡蛋白表達、細胞滲出及減輕肺組織損傷程度；并且發現在該模型的肺泡巨噬細胞中，GGPPS 表達也升高。肺泡巨噬細胞在炎癥早期階段即發生激活，并能釋放多種炎癥因子，在炎癥的進程中發揮重要的作用[21]。如果在早期階段阻止肺泡巨噬細胞對過度炎癥的啟動，將在ARDS 的臨床治療中獲益。本研究通過檢測ARDS 患者及正常體檢人群外周血單個核細胞中GGPPS 的表達情況，分析其與APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分的相關性等，明確GGPPS 在ARDS 中的臨床意義，進一步驗證動物實驗的結果，為ARDS 的病情判斷、預后評估及進一步研究提供依據。

本研究發現ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 及蛋白表達水平均明顯高于正常對照人群。這一結果與在慢性香煙煙霧暴露誘導的肺部炎癥研究[10]中肺組織的GGPPS 表達變化趨勢一致，與本研究組前期研究[12]中急性肺損傷小鼠肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞中GGPPS 變化趨勢一致。前期研究[12]發現，GGPPS 通過調節小G 蛋白Rab10 在細胞膜的分布而影響Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）-LPS 信號通路的活性，并最終調控核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 （nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）炎癥體的活性。本研究結果顯示，ARDS 患者中，外周血單個核細胞GGPPS mRNA 的高表達與高C 反應蛋白及高白細胞計數相關，進一步驗證了前期研究結果，提示GGPPS 與ARDS 炎癥程度相關，GGPPS 可能參與ARDS 的炎癥過程。前期研究[12]發現，肺泡上皮細胞GGPPS 表達呈LPS 作用時間及濃度依賴性增加，肺部炎癥越重，GGPPS 表達越高；而本研究發現ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS 表達水平隨ARDS 病情加重逐漸升高，其表達趨勢與前期研究中GGPPS 的變化趨勢較一致，提示GGPPS 與ARDS 病情嚴重程度相關。APACHE Ⅱ評分是目前公認的危重疾病綜合評估模型，包含多項重要的臨床體征及實驗室指標，其分值越高表明患者的狀態越差，死亡的可能性越大，能夠較為全面地反映患者機體狀況和評估危重患者的預后；SOFA 評分也是常用的急重癥評分系統，分值越高，患者病死率越高[22]。柏林診斷標準[13]提出氧合指數與ARDS 患者病情嚴重程度及預后密切相關。本研究結果顯示ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 高表達與高APACHE Ⅱ評分、高SOFA 評分、低氧合指數相關。ARDS 患者死亡組外周血單個核細胞中GGPPS mRNA 及蛋白表達水平均明顯高于存活組。以上結果提示GGPPS 與ARDS 疾病嚴重程度及預后有關，GGPPS 表達越高，患者病情越重，預后 越差。

綜上所述，本研究結果提示ARDS 患者外周血單個核細胞中GGPPS 表達水平升高預示病情危重及預后不良。關于GGPPS 是否有望成為治療ARDS 的作用靶點，需要進一步通過細胞、動物及臨床試驗進行深入研究。此外，本研究存在不足之處，例如缺少對患者治療期間GGPPS水平的動態評估，有待于今后進一步探索。

參·考·文·獻

[1] Fan E, Brodie D, Slutsky AS. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment[J]. JAMA, 2018, 319(7): 698-710.

[2] Bellani G, Laffey JG, Pham T, et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries[J]. JAMA, 2016, 315(8): 788-800.

[3] Garcia-Laorden MI, Lorente JA, Flores C, et al. Biomarkers for the acute respiratory distress syndrome: how to make the diagnosis more precise[J]. Ann Transl Med, 2017, 5(14): 283.

[4] Ware LB, Koyama T, Zhao Z, et al. Biomarkers of lung epithelial injury and inflammation distinguish severe sepsis patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Crit Care, 2013, 17 (5): R253.

[5] Jabaudon M, Blondonnet R, Roszyk L, et al. Soluble receptor for advanced glycation end-products predicts impaired alveolar fluid clearance in acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2015, 192(2): 191-199.

[6] Geboers DG, de Beer FM, Tuip-de Boer AM, et al. Plasma suPAR as a prognostic biological marker for ICU mortality in ARDS patients[J]. Intensive Care Med, 2015, 41(7): 1281-1290.

[7] Calfee CS. ARDS in 2015: new clinical directions, new biological insights[J]. Lancet Respir Med, 2015, 3(12): 912-913.

[8] Reid TS, Terry KL, Casey PJ, et al. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity[J]. J Mol Biol, 2004, 343(2): 417-433.

[9] Xu N, Shen N, Wang X, et al. Protein prenylation and human diseases: a balance of protein farnesylation and geranylgeranylation[J]. Sci China Life Sci, 2015, 58 (4): 328-335.

[10] Shen N, Gong T, Wang JD, et al. Cigarette smoke-induced pulmonary inflammatory responses are mediated by EGR-1/GGPPS/MAPK signaling[J]. Am J Pathol, 2011, 178(1): 110-118.

[11] Wang XX, Ying P, Diao F, et al. Altered protein prenylation in sertoli cells is associated with adult infertility resulting from childhood mumps infection[J]. J Exp Med, 2013, 210(8): 1559-1574.

[12] Xu WJ, Wang XX, Lv TF, et al. Inhibition of GGPPS1 attenuated LPS-induced acute lung injury by suppressing the NLRP3 inflammasome[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2019, 316(3): L567-L577.

[13] Force ADT, Ranieri VM, Rubenfeld GD, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J]. JAMA, 2012, 307(23): 2526-2533.

[14] Jacobson JR, Barnard JW, Grigoryev DN, et al. Simvastatin attenuates vascular leak and inflammation in murine inflammatory lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 288(6): L1026-1032.

[15] Bajwa EK, Malhotra CK, Thompson BT, et al. Statin therapy as prevention against development of acute respiratory distress syndrome: an observational study[J]. Crit Care Med, 2012, 40(5): 1470-1477.

[16] Yeganeh B, Wiechec E, Ande SR, et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease[J]. Pharmacol Ther, 2014, 143(1): 87-110.

[17] McAuley DF, Laffey JG, O'Kane CM, et al. Simvastatin in the acute respiratory distress syndrome[J]. N Engl J Med, 2014, 371(18): 1695-1703.

[18] National Heart, Lung, Blood Institute ARDS Clinical Trial Network, Truwit JD, Bernard GR, et al. Rosuvastatin for sepsis-associated acute respiratory distress syndrome[J]. N Engl J Med, 2014, 370(23): 2191-2200.

[19] Ahmed TA, Hayslip J, Leggas M. Pharmacokinetics of high-dose simvastatin in refractory and relapsed chronic lymphocytic leukemia patients[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2013, 72(6): 1369-1374.

[20] Kim WS, Kim MM, Choi HJ, et al. Phase Ⅱ study of high-dose lovastatin in patients with advanced gastric adenocarcinoma[J]. Invest New Drug, 2001, 19(1): 81-83.

[21] Novak ML, Koh TJ. Macrophage phenotypes during tissue repair[J]. J Leukoc Biol, 2013, 93(6): 875-881.

[22] Falc?o ALE, Barros AGA, Bezerra AAM, et al. The prognostic accuracy evaluation of SAPS 3, SOFA and APACHE Ⅱ scores for mortality prediction in the surgical ICU: an external validation study and decision-making analysis[J]. Ann Intensive Care, 2019, 9 (1): 9-18.