外源益生菌對塑料袋發酵全株青綠玉米霉變的影響

李川皓，劉艷艷，金娉婷，趙紅波，李會榮，王星凌，盛清凱

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東省農業科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100；3.山東省飼料質量檢驗所，山東 濟南 253600）

目前國家大力實施糧改飼戰略。糧改飼，以全株青貯玉米為重點。玉米，我國種植面積最大，為主要糧飼作物。過去常用青貯池或青貯窖將蠟熟期或完熟期的全株玉米青貯后飼喂牛羊，目前也用塑料袋或噸包將乳熟期的全株青綠玉米厭氧發酵后飼喂生豬［1］。全株青綠玉米塑料袋發酵與蠟熟期、完熟期全株玉米青貯池青貯存在異同。差異之處在于：前者全株玉米一般乳熟期收割，粉碎至0.2～0.5 cm小段，添加外源菌，厭氧發酵7 d后飼喂生豬；后者全株玉米一般蠟熟期或完熟期收割，粉碎至1～3 cm小段，發酵2個月后飼喂牛羊。相同之處在于：二者全株玉米皆易與氧氣接觸霉變。塑料袋發酵霉變的全株玉米常含有白色斑塊或菌絲，其霉變的菌種屬性未見報道，霉變機理也不清楚。塑料袋發酵全株玉米時，常常添加外源乳酸菌、枯草芽孢桿菌等［1］，用以提高營養品質及達到保鮮、長期貯存的目的，但外源菌對其霉變的影響尚不清楚。霉變不但降低青貯玉米的營養品質，還容易導致家畜疾病的發生［2］。青貯玉米霉變真菌主要為酵母［3］及霉菌［4］。本試驗旨在確定塑料袋發酵全株青綠玉米中霉變真菌的菌種屬性，研究外源菌對霉變全株青綠玉米中菌、酶等指標的影響，探討霉變及影響機理，為糧改飼提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳熟期的全株青綠玉米，臨邑綠葉種豬場提供。枯草芽孢桿菌和乳酸菌，其含量分別為1×109cfu/g和1×107cfu/g，皆由山東省農業科學院畜牧獸醫研究所提供。TIANGEN真菌提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產。丙二醛、羥自由基、過氧化氫酶、過氧化物酶、總抗氧化能力、檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶、NADH氧化酶試劑盒，皆由南京建成生物工程公司生產。微生物培養基，由北京陸橋技術股份公司生產。麩皮等，市場購買。

1.2 試驗設計

試驗于2019年9月進行。采用2×2析因試驗設計。將剛收割的乳熟期全株青綠玉米粉碎至0.2～0.4 cm，然后與30%的麩皮混合。將混合物隨機均分為對照組（CG）和試驗組（TG）。對照組不添加外源菌，試驗組添加外源菌，外源菌添加量為0.1‰。外源菌為枯草芽孢桿菌和乳酸菌的混合菌，其含量分別為1×109cfu/g和1×107cfu/g。將對照組及試驗組各自均分10份，分別裝入塑料袋中在同等條件下厭氧發酵。每組10袋，每袋高0.8 m、直徑0.6 m、重約70 kg。厭氧發酵0、7、15、45 d分別開袋，每次開袋5 min，開袋后重新排氣扎口。試驗中，發酵第45 d，各組外觀皆無霉斑出現。

厭氧發酵第90 d袋口及塑料袋側壁出現霉斑。塑料袋扎口處霉斑最大，為整個霉斑，成白色，直徑約為10 cm。塑料袋側壁多處出現霉斑，白色，霉斑直徑約為2 cm。當天剪開塑料袋快速剝離對照組和試驗組直徑為2 cm左右的霉斑，分別記為對照組霉斑樣品（CG-M）和試驗組霉斑樣品（TG-M），并液氮保存帶回實驗室進行真菌多樣性分析。以霉斑圓點為核心，選取周邊距圓點7 cm處有代表性位點三處，取對照組和試驗組無霉斑樣品100 g，分別為對照組無霉斑樣品（CG-NM）和試驗組無霉斑樣品（TG-NM），液氮保存帶回試驗室進行分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 霉斑真菌18SrDNA基因全序列的克隆和分析 使用真菌提取試劑盒進行DNA抽提。以nu-ssu-0817、NS8為擴增引物，擴增真菌18S rDNA基因部分序列1 000 bp左右。PCR反應體系（50μL）：DNA 2μL，EX Taq 0.25μL，10×Buffer 5μL和2μL的nu-ssu-0817（10μmol/L）、2μL的NS8（10μmol/L），加水至50μL。PCR程序：95℃預變性3 min，32次PCR循環（95℃變性45 s，55℃變性45 s，72℃變性90 s），最后72℃延伸10 min，10℃保存。將回收后的2μg PCR產物與PMD18-T載體16℃過夜連接，10μL連接產物全部加入至100μL DH5α感受態細胞中，冰上放置30 min；42℃熱激45 s后，放置冰上1 min，加入890μL AMP陰性培養基，37℃振蕩培養60 min，取100μL鋪板。構建3個18S rDNA克隆庫。從每個樣品克隆庫中挑選100個克隆子PCR擴增跑瓊脂糖凝膠進行克隆子篩選，對篩選出的克隆子進行測序（正反兩個方向）、序列組裝、拼接，得到完整18S rDNA序列，然后在NCBI數據庫中BLAST分析鑒定真菌菌種的屬性。

1.3.2 菌、酶及自由基等指標檢測 檢測時將樣品與水按重量比1∶9混合，浸泡30 min后3 000 r/min離心，取上清液進行菌、酶等指標檢測。乳酸菌、酵母、霉菌，采用平板計數法，乳酸菌為MRS培養基培養，霉菌及酵母采用CM123馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基培養。丙二醛、羥自由基、過氧化氫酶、過氧化物酶、總抗氧化能力、檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶、NADH氧化酶，按試劑盒要求檢測。

1.4 數據處理

采用SAS v9.2軟件對所有數據進行處理。采用TWO-WAY ANOVA進行方差分析，采用Student-Newmnan-Keuls法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 霉變全株青綠玉米真菌屬性與多樣性分析

從分析結果（表1）看出，霉變全株青綠玉米的真菌為假絲酵母、煙紅曲霉和釀酒酵母。

表1 霉變玉米的真菌屬性

由圖1看出，CG-NM組與TG-NM組相比，CG-M組與TG-M組相比，加菌組中真菌種類皆減少釀酒酵母。CG-NM組與CG-M組相比，TG-NM與TG-M組相比，霉變組中的真菌皆增加煙紅曲霉。

圖1 霉變全株玉米真菌多樣性分析

2.2 添加外源菌對霉變全株青綠玉米菌群的影響

由表2看出，對于乳酸菌而言，霉變效應、加菌效應及二者的互作效應皆顯著（P＜0.05）。霉變及加菌皆降低乳酸菌的含量，四組樣品中TGNM乳酸菌含量最高，TG-M 乳酸菌含量最低。對于酵母，霉變效應、加菌效應及二者的互作效應也皆顯著（P＜0.05）。霉變及加菌皆升高酵母的含量，四組樣品中TG-M 酵母含量最高，CGNM酵母含量最低。對于pH，霉變效應及加菌效應皆顯著（P＜0.05），但二者互作效應不顯著（P＞0.05），霉變極顯著升高pH（P＜0.01），而加菌相反（P＜0.05）。

表2 外源菌對霉變全株青綠玉米菌群及pH值的影響

2.3 添加外源菌對全株青綠玉米自由基及清除劑的影響

由表3看出，對于羥自由基而言，霉變效應顯著（P＜0.05），而加菌效應及二者互作皆不顯著（P＞0.05），霉變提高羥自由基含量。對于丙二醛，霉變效應、加菌效應顯著，二者皆升高丙二醛含量（P＜0.05）。對于過氧化氫酶，盡管霉變和加菌皆升高過氧化氫酶含量，但霉變及加菌效應皆不顯著（P＞0.05）。對于過氧化物酶，霉變效應及加菌效應皆極顯著（P＜0.01），霉變增強該酶活性，而加菌相反（P＜0.01）。

表3 外源菌對霉變全株青綠玉米自由基及清除劑的影響

2.4 外源菌對全株青綠玉米總抗氧化能力及酶活的影響

由表4看出，對于總抗氧化能力而言，霉變及加菌皆顯著降低全株玉米的總抗氧化能力（P＜0.05），二者無互作（P＞0.05）。霉變及加菌對于檸檬酸合成酶皆無影響（P＞0.05）。對于乳酸脫氫酶，霉變及加菌皆降低該酶活性（P＜0.05）。對于NADH 氧化酶，霉變升高該酶活性（P＜0.01），而加菌對該酶活性無影響（P＞0.05）。

表4 外源菌對霉變全株青綠玉米抗氧化能力及酶活的影響

3 討論與結論

關于塑料袋發酵霉變玉米的真菌研究未見報道。目前普遍認為酵母［3］、霉菌［4］等真菌及好氧菌導致了青貯全株玉米霉變。本試驗發現塑料袋發酵霉變全株玉米的真菌為酵母和霉菌，這和全株玉米青貯霉變真菌相似，差異之處在于酵母、霉菌類型不同。本試驗中塑料袋發酵玉米真菌為假絲酵母、釀酒酵母和煙紅曲霉，而青貯霉變真菌為假絲酵母、漢遜酵母、粉紅擲孢酵母、深紅酵母等酵母［5］及煙曲霉［6］、青霉［7］等霉菌。塑料袋發酵玉米霉變后煙紅曲霉菌增多，這可能與霉變初期主要為酵母發揮作用、霉變后期主要為霉菌發揮作用有關［8］。添加外源菌后全株玉米中減少了釀酒酵母，可能原因為乳酸菌［9］或乳酸等有機酸［10，11］殺滅了釀酒酵母，這和本試驗添加外源菌后pH降低的結果相一致。

目前未見塑料袋發酵全株玉米霉變效應和加菌效應關于乳酸菌及酵母的報道。本試驗中添加外源菌增加了未霉變玉米中乳酸菌含量的結果，與青貯結果［11，12］一致。本試驗中霉變及添加外源菌皆降低霉變玉米中乳酸菌的含量、增加酵母的含量，且二者互作顯著，推測其主要原因可能為乳酸菌被耐酸性的酵母利用［9，11］，也可能與乳酸菌自身厭氧且中間多次取樣導致乳酸菌衰減有關［13］。乳酸菌和酵母之間的關系有待進一步驗證。

全株玉米霉變，表面看是霉菌作用的結果，實質仍是自由基代謝紊亂的結果［14，15］。正常情況下自由基的產生與清除保持平衡，當該平衡被破壞時飼料或食物變質。本試驗中全株玉米霉變，即升高了羥自由基、丙二醛的含量，也升高清除劑過氧化氫酶、過氧化物酶的含量，但總抗氧化能力降低，表明自由基相對過量產生，這與自由基紊亂導致食物變質、疾病病變的常規一致［16］。本試驗中添加外源菌降低了霉菌全株玉米總抗氧化能力的結果與外源菌降低霉變玉米中乳酸菌含量的結果相一致，推測總抗氧化能力降低與乳酸菌含量降低有關。

自由基的產生及清除與電子轉移有關。檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶及NADH氧化酶皆是糖酵解中的關鍵酶，其中乳酸脫氫酶主要作用是催化乳酸氧化為丙酮酸，將氫轉移給NAD變成為NADH；NADH氧化酶催化NADH氧化為NAD+，同時將O2還原為H2O或H2O2。目前未見霉變效應及加菌效應關于乳酸脫氫酶及NADH氧化酶的報道。本試驗霉變降低全株玉米乳酸脫氫酶及升高NADH氧化酶的活性，應與H+與O2-有關，這與霉變導致羥自由基、丙二醛升高的試驗結果相一致。外源菌降低乳酸脫氫酶及升高NADH氧化酶的活性，其機理不清，但該結果與外源菌降低過氧化物酶及總抗氧化能力的結果相一致——由于乳酸脫氫酶及NADH氧化酶廣泛存在于乳酸菌［17，18］中，推測其影響機理可能與乳酸菌被耐酸性的酵母利用［9，11］有關。由于添加的外源菌中除乳酸菌外還含有枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌對霉變的影響有待深入研究。