氬氣貯藏對玉米種子老化過程中活力及生理特性的影響

田茜，段乃彬，張文蘭，李群，顏廷進，戴雙，丁漢鳳

（山東省農作物種質資源中心，山東 濟南 250100）

種子使植物能夠在惡劣環境下生存，并將遺傳信息傳給下一代。然而種子成熟后，隨著貯藏時間延長其生理生化狀態會發生一系列變化，導致其生活力、活力逐漸下降，直至衰老死亡，這種伴隨著種子貯藏時間的增加而發生和發展的自然的不可逆的過程，即為種子劣變或老化［1］。種子老化過程中會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS會導致種子內部發生一系列的生化裂變，包括膜透性增加、酶活性降低、貯藏物質減少等［2-4］。種子老化不僅能夠降低種子貯藏期間的生活力，同時也是影響植物生長發育和作物產量的主要原因之一［5］。在農業生產中，種子老化會導致巨大的經濟損失和遺傳資源損失［6］。因此，如何延緩種子老化及提高老化種子活力的研究備受關注，研究種子老化過程中的各種生理生化變化、提高種子活力和保存期限，對農牧業生產和種質保存有著重要的指導意義。

種子含水量、貯藏溫度和氣體成分是影響種子貯藏壽命的關鍵因素，調控適宜的貯藏條件可以延緩種子老化速度，提高種子貯藏壽命。氣調貯藏作為一種綠色環保、安全有效的貯藏技術，通過控制氣體成分來降低氧含量，從而有效降低種子貯藏過程中的氧化損傷，延長種子的貯藏壽命，得到越來越多的關注。目前，氣體對種子貯藏過程中活力及品質影響的研究主要集中在N2和CO2。羅廣華等［7］研究發現，N2和CO2有延緩38～40℃人工老化貯藏花生種子老化的效果；涂杰等［8］對比了CO2氣調儲藏與常規儲藏對粳秈稻谷品質的影響，發現CO2氣調儲藏比常規儲藏品質變化緩慢；王若暉等［9］也發現，高溫下充CO2氣調儲藏能延緩青稞品質的降低。近年來開展充氮氣調貯藏對種子品質影響的研究較多，研究發現充氮氣調可以有效減緩高溫對玉米、高粱、秈糙米品質的影響［10-12］；付家榕等［13］研究發現，充氮氣調能在一定程度上延緩大豆貯藏過程中的老化。

氬氣（Ar）屬于惰性氣體，無毒無味，化學活性低，價格低廉。用氬氣進行瓜果蔬菜保鮮是近年的一種新穎的食品保鮮技術。在一定的壓力下，氬氣可以與水果和蔬菜細胞間的水分子形成一種特殊的“籠形水合物”［14］，這種水合物不僅限制了水果和蔬菜中水分子的活動，而且能抑制酶活性和代謝生理活動，降低呼吸速率，最終抑制其褐變和成熟，從而達到保鮮的效果［15，16］。該技術具有無毒副作用、操作簡單、效果明顯等優點，得到了越來越多的關注。但目前尚未見氬氣用于種子保存及其對種子老化影響的相關報道。因此，本研究用人工老化模擬自然老化，采用氬氣和空氣貯藏兩種方式，研究氬氣氣調貯藏對玉米種子老化過程中活力和生理生化特性的影響，探討氬氣對種子老化的影響，以期為種子安全保存新方法的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

試驗所用玉米（Zea mays L.）品種為‘鄭單958’，由山東省農作物種質資源中心種質保存中期庫提供。種子初始發芽率為99%，初始含水量為10.2%。

取種子樣品500 g儲存于廣口瓶中用雙孔塞子進行密封，按圖1工藝充入氬氣，用氣體分析儀檢測氣體濃度，當模擬倉內充滿氬氣時，立即關掉閥門，密封瓶口。以充滿空氣為對照。將種子置于60℃的人工老化箱內進行老化處理，每隔12 h取樣，測定種子活力及各項生理指標。

圖1 模擬倉充氬氣工藝流程

1.2 生理指標的測定

發芽指標的測定參照國際種子檢驗協會（ISTA）的《種子檢驗規程》（1996）［17］進行。隨機選取100粒種子，放入鋪有兩層濾紙的發芽盒中，重復4次，將發芽盒置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養，每日統計發芽種子數。發芽結束后分別計算不同處理種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數。

發芽勢Gp＝第3 d時發芽種子數/種子總數×100%；

發芽率G＝第7 d時發芽種子數/種子總數×100%；

發芽指數GI＝Σ（Gt/Dt）；

活力指數VI＝GI×DW。式中，Gt為第t天發芽種子數，Dt為相應發芽天數，DW 為幼苗干重。

種子電導率：取3份玉米種子，每份20粒，用去離子水沖洗3次，迅速用濾紙吸干種子表面水分，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL去離子水，置于25℃恒溫培養箱中24 h。用METTLERTOLEDO 326電導率儀（Delta 326，METTLERTOLEDO，China）測定種子初始電導率（a1），然后將種子及其浸出液置于100℃水浴中煮沸30 min，取出冷卻至25℃，測定煮沸后種子浸出液的電導率（a2）。根據公式計算浸出液的相對電導率。

相對電導率（%）＝（a1/a2）×100。

將老化不同時間的玉米種子置于濕潤濾紙上吸脹24 h，剝取吸脹種胚測定丙二醛（MDA）和H2O2含量、超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）、抗壞血酸過氧化物酶（APX，EC 1.11.1.7）活性［18］。蛋白質濃度測定采用Bradford法［19］，以牛血清白蛋白為標準。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據統計與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 氬氣氣調貯藏對玉米種子萌發特性的影響

由表1可以看出，種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均隨著老化時間的延長而逐漸降低。空氣貯藏條件下各指標下降幅度較大，氬氣貯藏條件下各指標下降較空氣貯藏的緩慢，延緩了玉米種子的老化進程。在老化初期（12 h），空氣貯藏和氬氣貯藏種子的發芽指標差異不顯著；老化24 h后，二者的萌發指標均差異顯著，此時，氬氣貯藏仍能保持92.00%的發芽率，而空氣貯藏的發芽率已降至78.00%，發芽勢、發芽指數和活力指數也分別比空氣貯藏的提高了42.62%、19.75%、28.71%。至老化48 h時，氬氣貯藏種子的發芽率為52.00%，而空氣貯藏的僅為17.00%；氬氣貯藏種子的發芽勢、發芽指數和活力指數也維持在中等水平，而空氣貯藏的則均處于較低水平。人工老化72 h后，空氣貯藏種子的發芽率降為零，而氬氣貯藏的發芽率仍為17.00%。此外，空氣貯藏條件下種子發芽率下降50%的時間約為36 h，而氬氣貯藏的約為48 h。由此可見，氬氣貯藏延緩了種子活力下降的速度，對延緩種子老化進程、延長種子壽命具有一定的作用。

表1 氣調貯藏條件下老化不同時間玉米種子的發芽情況

2.2 氬氣氣調貯藏對玉米種子浸出液電導率及MDA和H2 O2含量的影響

MDA是不飽和脂肪酸氧化的最終產物，其含量高低是衡量脂質過氧化程度的重要指標。種子浸出液電導率是表示細胞膜完整性的重要指標。圖2顯示，在空氣貯藏和氬氣貯藏條件下，種子浸出液的相對電導率、MDA和H2O2含量均隨老化時間的延長逐漸升高。氬氣貯藏的相對電導率、MDA和H2O2含量均低于空氣貯藏，且從老化24 h開始，二者差異顯著。人工老化36 h時，氬氣貯藏玉米種子的電導率、MDA和H2O2含量比空氣貯藏分別降低了22.87%、26.84%、33.02%。表明，隨著老化時間的延長，種子中活性氧（ROS）大量產生并積累，但氬氣貯藏在一定程度上抑制了老化種子中ROS的產生，降低了脂質過氧化程度，有效緩解了老化引起的氧化損傷。

圖2 老化不同時間玉米種子的相對電導率及MDA和H2O2含量變化

2.3 氬氣氣調貯藏對玉米SOD、APX活性的影響

SOD和APX是清除活性氧的重要抗氧化酶。SOD是抗氧化系統的第一道防線，它可以把O·-2歧化成H2O2。APX是ASC-GSH循環中的關鍵酶，也是清除H2O2的主要酶。由圖3可知，在兩種貯藏方式下，玉米種胚中SOD、APX活性表現出相同的變化趨勢，都在老化初期增加，而后迅速下降，氬氣貯藏的酶活性顯著高于空氣貯藏。老化12 h，SOD、APX活性達到峰值，空氣貯藏的較未老化的分別增加5.17%、4.10%，氬氣貯藏的則分別增加19.25%、15.57%，且氬氣貯藏種子的酶活性顯著高于空氣貯藏，分別比空氣貯藏高出13.39%、11.02%。老化48 h，與空氣貯藏相比，氬氣貯藏種子種胚中SOD、APX活性分別高出86.25%、46.43%。表明人工老化過程中，氬氣貯藏抑制了種子中SOD、APX活性的降低，維持了較高的保護酶活性，提高了老化種子抵御ROS侵害的能力。

圖3 老化不同時間玉米種子的SOD、APX活性

3 討論與結論

老化是貯藏過程中影響種子質量和活力的主要因素。本研究結果表明，在人工老化過程中，反映玉米種子萌發特性的各個指標（發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數）均下降，這與孫守江等的研究結果一致［20］，與空氣貯藏相比，在氬氣貯藏條件下玉米種子各萌發指標降速緩慢，這與CO2氣調［7-9］和充氮氣調［10-13］對種子老化研究的結果一致。羅廣華等［7］推測，這與種子的氣相缺氧有關，充氬氣貯藏實質上是阻斷了O2與種子接觸，直接抑制了種子的呼吸作用；而種子呼吸作用的減弱又可以減少呼吸鏈中ROS的產生，降低細胞的脂質過氧化程度和其他細胞器損傷，從而延緩種子老化。

老化的自由基理論認為，ROS的產生和積累是導致種子老化的主要原因；在種子貯藏過程中，ROS的積累會導致脂類、DNA和蛋白質的氧化損傷，從而導致種子萌發能力降低，活力喪失［21］。本試驗中隨著老化時間的延長，種子中H2O2逐漸積累，MDA含量和相對電導率不斷增加，這與前人對玉米的研究結果一致［22-24］，說明老化導致ROS積累，引發了膜脂過氧化，細胞膜透性增加。SOD、APX是植物體內ROS的清除劑，可以使細胞內的ROS維持在正常水平，防止氧化損傷。本試驗中SOD、APX活性均逐漸降低，這與鮮萱等［25］的研究結果一致，說明老化導致種子的抗氧化能力下降。而在氬氣貯藏條件下，與空氣對照相比，相對電導率、MDA和H2O2含量增加緩慢，SOD、APX活性降低也緩慢，說明氬氣貯藏延緩了種子裂變的速度。這可能是由于氬氣降低了脂質的氧化程度，減少了ROS的產生和積累，同時又通過維持較高的抗氧化酶活性，不斷清除ROS，避免ROS過量積累，從而降低其對細胞的氧化損傷，延緩種子的老化進程。

綜上所述，相較于空氣貯藏，氬氣貯藏能夠減緩玉米種子各萌發指標的降低速度，降低種子的相對電導率及MDA和H2O2含量，提高SOD、APX活性，在一定程度上延緩了玉米種子的老化進程。