不同品種花生衣原花青素含量及抗氧化活性研究

宋昱，方策，2，馬飛，張初署，于麗娜，畢潔，王明清，于淼，遲曉元，張建成，孫杰，江晨

（1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.山東師范大學，山東 濟南 250014；3.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；4.遼寧省農業科學院食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

花生屬于油料作物，它作為重要創匯農產品和具有很強國際競爭力的大型農產品［1］，近年來在國內市場和世界貿易中的地位及影響力一直處于上升狀態［2］。我國花生產量及出口量從2000年以來一直穩居前列［3］。花生在農產品經濟和貿易中的地位十分重要［4-6］。

花生衣是花生的種皮，具有止血、化瘀、消腫等功效。它主要由蛋白質、纖維素、脂肪、灰分以及少量單寧、色素等物質組成［7-9］。花生衣含有多種活性成分，其中引起較多關注的是原花青素［10］。

原花青素（proanthocyanidin，PC）廣泛存在于很多植物中，其基本結構是有C6-C3-C6骨架，具有水溶性、醇溶性、無毒無過敏性。PC屬于酚類物質，主要由兒茶素單體、表兒茶素單體、表兒茶素沒食子酸酯單體、沒食子酸單體、原花青素B1、原花青素B2以及由單體通過C4-C6鍵、C6-C8鍵結合而形成的低聚體、高聚體等組合而成的混合物。原花青素具有很好的功能活性［11］，能夠抑制腫瘤、改善人體微循環、抗炎、抑制血小板凝聚及脂質過氧化，還能提高人體免疫力、預防紫外線輻射、抗衰老、抗疲勞、抗基因突變、保護心血管等［9，12-21］。PC還可通過抑制葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白-酪氨酸磷酸酶等起到預防糖尿病的作用［22］；也可通過抑制乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿脂酶、淀粉樣前體蛋白裂解酶來抑制淀粉樣肽的自我聚集，可提高突觸的可塑性以及改善大腦血流，提高血漿的還原能力［23］。因此原花青素可以被開發成防治心腦血管的藥物、天然的抗氧化劑以及綠色化妝品等［14，24］。國外以葡萄籽中原花青素作為主要活性成分的藥品或者食品的營養補充劑已經深入人們的日常生活［25，26］，而國內對這類產品的開發才剛剛起步，但發展勢頭很好，目前有不少企業正在著手這一類產品的研發以及生產［2，27，28］。

將花生衣中的原花青素提取出來作為藥物或者食品中的有效成分，是近年來研究的熱點。我國是花生生產大國，花生衣作為花生加工后的主要副產物，每年都會有幾十萬噸的產量。將花生衣作為提取原花青素的來源，不僅是對加工副產物的有效利用，而且還能帶來經濟利益。從原料方面來說，花生衣的來源廣且價格低，具有成本低的突出特點；從提取工藝來說，它操作簡便，儀器與試劑較易獲得，最終的提取率較高；從市場方面來說，它符合我國新時代的發展模式，具有很好的應用前景。本試驗以白玉花生、黑花生2號及花育23為材料，研究不同品種、不同種皮顏色、不同生長時期花生衣中的原花青素含量、組成及抗氧化活性，以期為花生衣高活性原花青素提取及進一步應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

2019年7—8月在山東省花生研究所萊西試驗站獲取白玉花生、黑花生2號及花育23各品種花生下針后30天和50天的花生衣。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，SIGMA-ALDRICH）和三羥甲基氨基甲烷（Tris，SIGMA-ALDRICH）及對照品兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸、原花青素B1、原花青素B2等，均購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈、四甲基乙二胺為色譜級試劑，其余均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器與設備

主要有：紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司產品）；HPLC-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司產品）；真空冷凍干燥機（美國西盟國際金西盟儀器有限公司產品）；循環水式多用真空泵（上海知信試驗儀器技術有限公司產品）；Centrifuge 5430R高速離心機（德國Eppendorf公司產品）。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同品種花生衣原花青素提取 將白玉花生、黑花生2號、花育23各品種花生下針生長30天和50天的花生衣樣品分別命名為白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）。分別取各樣品2 g放入研缽中研磨30 min，按照1∶5的料液比加入80%乙醇，于40℃超聲波處理20 min，將濾渣再重復提取2次，之后濾液混合定容到50 mL。取粗提液各0.5 mL，用80%乙醇稀釋4倍，供后續試驗使用。

1.3.2 原花青素含量測定 具體方法如下。

（1）原花青素標準曲線制作：稱取原花青素標準品10 mg用80%乙醇溶解，然后定容于10 mL棕色容量瓶中，得到1 mg/mL原花青素乙醇標準液，然后稀釋至0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL濃度梯度。分別取0.5 mL放入試管中，加入4%香草醛甲醇溶液3 mL，混勻，再加入濃鹽酸1.5 mL，徹底混勻，室溫下顯色15 min左右，于500 nm波長下測定吸光度，記錄數據制作標準曲線［29-33］。

（2）原花青素含量測定：按照上述原花青素含量測定方法即香草醛-鹽酸法測定6個樣品的吸光度值，每個樣品平行測3次。

1.3.3 不同品種花生衣原花青素組分HPLC分析 具體方法如下。

（1）色譜分析條件：色譜柱為kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫30℃；流動相為0.3%磷酸-乙腈（9∶1，V/V），流速0.7 mL/min，進樣量10μL，檢測波長278 nm。測定峰面積并帶入標準曲線方程中計算各待測液的原花青素含量。

（2）花生衣樣品液的組分測定：用針管吸取樣品液0.4 mL，0.22μm微孔濾膜（有機相）過濾到1.5 mL棕色小瓶中，上樣分析。

1.3.4 抗氧化活性測定 具體方法如下。

（1）不同品種花生衣原花青素DPPH自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.5 mL分別放于EP管中，均加入4.5 mmol/L DPPH溶液0.5 mL，充分混勻，室溫下反應20 min，于波長517 nm處測定吸光度，空白對照組以0.5 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［34］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ao］×100 。

式中，Ai為樣品與DPPH混合液吸光度；Aj為樣品與無水乙醇混合液吸光度；Ao為DPPH與無水乙醇混合液吸光度。

（2）不同品種花生衣原花青素羥自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.25 mL分別放于EP管中，均加入6 mmol/L七水合硫酸亞鐵0.25 mL，充分混勻，再加入6 mmol/L水楊酸液0.25 mL及6 mmol/L過氧化氫0.25 mL，混合均勻后37℃水浴加熱1 h，再于波長510 nm處測定吸光度，對照組以0.25 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［35］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Am-An）/Ap］×100 。

式中，Am為樣品與FeSO4、H2O2混合液吸光度；An為樣品與FeSO4、蒸餾水混合液吸光度；Ap為蒸餾水與FeSO4、H2O2混合液吸光度。

（3）不同品種花生衣原花青素超氧陰離子自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.5 mL分別放于EP管中，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液1.25 mL，25℃水浴保溫20 min后，加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，5 min后加入10 mol/L HCl溶液0.5 mL，于320 nm處測定吸光度，空白對照組以0.5 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［36］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ah-Ak）/Aq］×100 。式中，Ah為樣品與Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl混合液吸光度；Ak為樣品與Tris-HCl、蒸餾水、HCl混合液吸光度；Aq為蒸餾水與Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl混合液吸光度。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel處理數據與作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種花生衣原花青素含量的確定

2.1.1 原花青素標準曲線的確定 原花青素含量標準曲線如圖1所示，其線性方程為y＝1.772x+0.0082（R2＝0.9989）。

圖1 原花青素標準曲線

2.1.2 不同品種及生長時期花生衣的原花青素含量 由表1可知，白玉花生、黑花生2號、花育23花生下針后30天，其PC含量表現為花育23＞黑花生2號＞白玉花生；下針后50天，白玉花生、黑花生2號、花育23花生衣的PC含量均提高，且仍以花育23最高，達0.234 g/g，白玉花生最低，僅為0.003 g/g。與30天時相比，3個品種花生衣的PC含量表現為分別提高1.50、3.41倍和3.20倍。

表1 不同品種花生衣的原花青素含量

2.2 不同品種花生衣的原花青素組分分析

2.2.1 原花青素標準品的HPLC圖譜 原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素、兒茶素、沒食子酸和表兒茶素沒食子酸酯共6個標準品的HPLC圖譜如圖2所示。其標準曲線的線性方程為：（a）y＝5503.7x+19.567（R2＝0.9999）；（b）y＝5116.8x+29.466（R2＝0.9997）；（c）y＝6467.6x-4.0575（R2＝0.9986）；（d）y＝7103.2x+58.962（R2＝0.9983）；（e）y＝5607.5x+25.147（R2＝0.9981）；（f）y＝6829.1x+27.613（R2＝0.9989）。

圖2 原花青素B1（a）、原花青素B2（b）、表兒茶素（c）、兒茶素（d）、沒食子酸（e）和表兒茶素沒食子酸酯（f）標準品的HPLC圖譜

2.2.2 不同品種花生衣原花青素提取液組分測定結果 根據3個品種花生衣PC提取液結果（圖3）及其標準品HPLC圖譜（圖2）進行分析，可知，白花生3 PC提取液中含有沒食子酸和原花青素B1單體，其中沒食子酸含量為0.134 mg/g，原花青素B1含量為0.0746 mg/g；黑花生3 PC提取液中含有原花青素B2和沒食子酸單體，其中原花青素B2含量為0.0344 mg/g，沒食子酸含量為0.164 mg/g；花育23（3）PC提取液中含有兒茶素、沒食子酸、表兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中兒茶素含量為0.117 mg/g，沒食子酸含量0.169 mg/g，表兒茶素含量為0.209 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.0548 mg/g；白花生5 PC提取液中含有沒食子酸單體，其含量為0.169 mg/g；黑花生5 PC提取液中含有原花青素B2、沒食子酸、表兒茶素、兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中原花青素B2含量為0.593 mg/g，兒茶素含量為0.0808 mg/g，表兒茶素含量為0.150 mg/g，沒食子酸含量為0.113 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.369 mg/g；花育23（5）PC提取液中含有沒食子酸、表兒茶素、兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中兒茶素含量為1.302 mg/g，表兒茶素含量為0.316 mg/g，沒食子酸含量為0.0272 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.182 mg/g。根據以上結果可知，50天時各品種花生衣中PC單體的種類和含量與30天時具有明顯差異，其中黑花生5含單體種類最多，花育23（5）單體含量最高，而白玉花生花生衣中PC的單體種類和含量均不如其它兩個品種。

圖3 白花生3（a）、黑花生3（b）、花育23（3）（c）、白花生5（d）、黑花生5（e）和花育23（5）（f）PC提取液的HPLC圖譜

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 不同品種花生衣原花青素清除DPPH自由基效果 由圖4可知，所有品種花生衣PC提取液對DPPH自由基均具有一定的清除能力，但其清除能力不同。黑花生和花育23花生衣PC提取液的清除能力相對于白花生較強，其中清除能力最強的是花育23（5），達87.72%；清除能力最弱的是白花生3，僅為11.26%。表明，種皮顏色較深的黑花生和花育23其花生衣PC提取物清除DPPH自由基的能力優于顏色較淺的白花生；隨生育時間延長，3個品種花生衣PC清除DPPH自由基的能力均有提高。該結果與2.1.2原花青素含量測定結果一致。相關研究表明，原花青素清除DPPH自由基能力的強弱與含量呈正相關，濃度越大，清除效果越明顯［37］。

圖4 PC提取液清除DPPH自由基能力

2.3.2 不同品種花生衣原花青素清除羥自由基效果 由圖5可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液清除羥自由基的效果均較好，最強的是花育23（5）花生衣PC提取液，高達84.61%，最弱的是白花生3僅為42.40%。隨生育時間延長，3個品種花生衣PC提取液清除羥自由基的能力均有提高。綜合看，各品種花生衣PC提取液清除羥自由基能力：花育23＞黑花生＞白玉花生。

圖5 PC提取液清除羥自由基能力

2.3.3 不同品種花生衣原花青素清除超氧陰離子自由基效果 由圖6可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液對超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，但不同品種和生育時間對其清除能力影響較大。其中清除效果最好的是花育23（5），高達93.86%；清除效果最差的是白花生3，只有7.69%。隨著生育時間延長，下針后50天3個品種花生衣PC提取液清除超氧陰離子自由基的能力均優于30天的樣品。相關研究表明，原花青素可以通過抑制鄰苯三酚在堿性條件下的自氧化而實現超氧陰離子自由基（）的清除，并且其清除能力強弱同樣與含量呈正比，本試驗結果與其測定結果一致［34］。

圖6 PC提取液清除超氧陰離子自由基能力

3 結論

本試驗以白玉花生、黑花生2號和花育23各品種新鮮花生衣為原料，采用超聲波技術輔助、80%乙醇提取花生衣中的原花青素，用香草醛-鹽酸法及高效液相色譜（HPLC）法對原花青素單體組成含量及抗氧化活性（清除自由基能力）進行測定。結果表明，花育23（5）的原花青素含量最高，為0.234 g/g；3個品種花生衣原花青素組分中的單體種類及含量不同；清除DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基能力最強的均是花育23（5）花生衣PC提取液，最弱的均是白花生3花生衣PC提取液。本研究可為將花生衣原花青素開發成天然抗氧化劑提供一定參考。