扶腎方調節各種細胞因子干預腹膜間皮細胞EMT的實驗研究

楊波，王孟孟，李潔，喬延恒，楊洪濤△

腹膜透析（PD）是終末期腎臟病（ESRD）患者的重要腎臟替代療法。目前，全球PD患者約占透析人群的11%，并正以每年8%的速度增長［1］。長期PD易發生腹膜纖維化，導致超濾衰竭，最終迫使患者退出治療［2］。研究表明，裸露的腹膜間皮細胞從上皮細胞表型向間充質細胞表型轉化即上皮間質轉化（EMT）是腹膜纖維化的起始和可逆環節［3］。因此，明確腹膜間皮細胞EMT具體機制，對于防治腹膜纖維化具有重要意義。中藥復方因其多靶點調節的特點，在防治腹膜纖維化方面具有較好前景［4］。本課題組前期研究發現，扶腎方（院內制劑：津藥制字Z20130941）具有防治腹膜纖維化，延緩超濾衰竭的作用，但具體機制尚不明確［5］。本研究通過體外實驗探討扶腎方含藥血清對轉化生長因子-β1（TGF-β1）干預腹膜間皮細胞EMT過程中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、緊密連接蛋白-1（ZO-1）、轉化生長因子-β 受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）、TGF-βRⅡ、泛素連接酶Smad泛素化相關因子2（Smurf2）的影響及抑制腹膜間皮細胞EMT 的機制，為其應用于PD 相關腹膜纖維化防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 清潔級SD雄性大鼠26只，6周齡，體質量150～180 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證：SCXK（京）2016-0006。胰蛋白酶、DMEM 完全培養基、TGF-β1（母液濃度50 mg/L）、蛋白酶體抑制劑MG132（母液濃度10 mmol/L）、一抗β-actin（1∶500）、Smurf2（1∶200）購自北京中杉金橋生物有限公司；75%乙醇，10%水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠；手術器械（剪刀和鑷子），無菌注射器（20 mL 和1 mL），50 mL 無菌離心管購自北京市瑞康達醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腹膜間皮細胞分離及原代培養 大鼠20 只（每次5只，共4 次），行肌內注射10%水合氯醛約1 mL，待麻醉后向大鼠腹腔內注射20～30 mL 0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA 消化液。30 min 后斷頸處死大鼠，消化l h，75%乙醇全身浸泡消毒5 min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺上，沿腹中線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內液體，移入50 mL 離心管中。1 500 r/min離心15 min，棄上清，加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12 培養液，輕輕用吸管吹打使之成為細胞混懸液，種植于細胞培養瓶中。放入37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。約每3 d 更換1 次完全培養基。待細胞生長至培養瓶底60%～70%時，進行傳代培養，第2代用于后續實驗。

1.2.2 腹膜間皮細胞EMT 模型建立及鑒定 基于前期實驗和參考文獻［6］，采用40 μg/L TGF-β1 因子刺激培養的2 代大鼠腹膜間皮細胞24 h建立EMT模型。模型鑒定：倒置顯微鏡下觀察細胞數量、生長狀態及形態變化；上皮E-cadherin、ZO-1可作為腹膜間皮細胞EMT的特異生物標志物。

1.2.3 扶腎方含藥血清的制備 采用大鼠灌胃法制備含藥血清，6只大鼠按隨機數字表法分為空白對照組和扶腎方組，每組3只，扶腎方組每只大鼠灌胃2 mL（扶腎方含量為162 g/L）連續7 d，最后一次灌胃后2 h，麻醉后經股動脈取血10 mL，分離含藥血清，空白對照組大鼠灌胃等劑量生理鹽水，其他操作同扶腎方組。扶腎方以中藥飲片為原料，經過提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成。按照藥物人和大鼠體表面積計算方法，折算系數為0.018。扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g，按照折算系數計算出大鼠等效劑量為0.324 g。分離得到的血清經0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，56 ℃30 min滅活補體，制成含藥血清，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 細胞實驗分組及干預 細胞實驗分為5組：空白對照組（C組，正常培養基培養腹膜間皮細胞24 h）；最佳含藥血清組（B 組，正常培養基加大鼠含藥血清培養腹膜間皮細胞24 h）；模型組（T組，40 μg/L TGF-β1因子刺激腹膜間皮細胞24 h）；模型+含藥血清組（T+B 組，在模型組處理上加上最佳含藥血清干預24 h）；模型+MG132組（T+M組，在模型組處理上加 MG132 干預 24 h）。將 40 μg/L TGF-β1 干預腹膜間皮細胞，作用時間選擇 6、12、24 及 48 h，通過MTT 檢測細胞的活力，最終確定24 h為干預時間。

1.2.5 實時熒光定量 PCR（qPCR）檢測E-cadherin、ZO-1、TGF-βRⅠ，TGF-βRⅡ的mRNA 水平 按試劑盒步驟提取每組細胞總RNA，測定提取RNA純度，逆轉錄反應合成cDNA，再進行qPCR，引物序列見表1。PCR 反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板2 μL，加ddH2O至總體系25 μL。擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，30個循環。將各樣品cDNA稀釋10倍后取2 μL 作模板，分別用目的基因引物和內參基因（GAPDH）引物進行擴增，重復檢測孔道數為3，在60～95 ℃進行熔解曲線分析。采取2-ΔΔCt進行數據的相對定量分析。

Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length表1 引物序列及擴增片段長度

1.2.6 蛋白印跡法檢測Smurf2 蛋白的表達 將培養的各組細胞棄上清，用無菌PBS清洗3次后，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，低溫高速離心機4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取其上清液，BCA 法測定蛋白濃度。以30 μg 蛋白質溶液為總上樣量，取適量體積5×SDS（十二烷基苯磺酸鈉）上樣緩沖液充分混勻，100 ℃變性10 min，經凝膠電泳分離后，將蛋白轉移到PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗β-actin（1∶500）、Smurf2（1∶200）過夜。緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下孵育帶有HRP標記羊抗鼠IgG（1∶20 000）二抗1.5 h，緩沖液洗膜3次，每次10 min。使用化學發光成像系統采集圖像，Image J v2.1.4.7軟件進行分析統計，計算各組蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，以Levene 法進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用LSD-t法，若方差不齊，采用Games-Howell 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態的觀察 原代培養的細胞在第1天可見呈分散的小圓形細胞，24 h 后大部分細胞開始貼壁生長，形態仍為圓形，細胞數量較多。第3天細胞的形態趨于一致，數量較第1 天少；第5 天細胞形態多種多樣，有圓形、橢圓形、梭形、多角形等，邊緣不齊。第7天細胞經過充分融合，細胞呈現多邊形，形態較一致，部分細胞間連接較為緊密。見圖1。

2.2 各組腹膜間皮細胞E-cadherin、ZO-1mRNA比較 與 C 組比較，T 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表達均下調（P＜0.05）；與 T 組比較，B 組和T+B 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表 達 均 上 調 ，T+M 組E-cadherin、ZO-1mRNA表達均下調（P＜0.05）；與B組比較，T+B 組和 T+M 組E-cadherinmRNA 表達下調，T+M 組ZO-1mRNA 表達下調（P＜0.05）；與T+B 組比較，T+M 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表達均下調（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Transcription levels of E-cadherin and ZO-1 mRNA in peritoneal mesothelial cells in five groups表2 5組腹膜間皮細胞E-cadherin、ZO-1 mRNA轉錄水平 （n=6，）

Tab.2 Transcription levels of E-cadherin and ZO-1 mRNA in peritoneal mesothelial cells in five groups表2 5組腹膜間皮細胞E-cadherin、ZO-1 mRNA轉錄水平 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與 T 組比較，c與B 組比較，d與T+B 組比較，P＜0.05；表3同

ZO-1 1.00±0.04 0.79±0.05a 1.37±0.10b 1.29±0.06b 0.40±0.03bcd 84.924＊＊組別C組T組B組T+B組T+M組F E-cadherin 1.01±0.14 0.60±0.13a 1.76±0.47b 0.91±0.15bc 0.21±0.11bcd 17.403＊＊

2.3 各干預組腹膜間皮細胞形態 取培養的第2代腹膜間皮細胞進行實驗，鏡下細胞生長狀態較好，細胞完全融合后進行實驗干預。C組腹膜間皮細胞呈圓形、橢圓形、多邊形的上皮樣細胞。T 組經造模后，細胞數量明顯減少。B 組細胞數量也較C 組減少，但較T 組細胞數量多，且有少量細胞呈現長梭形。T+B組干預后，細胞數量較模型組明顯增多，細胞形態較為一致。T+M 組細胞數量明顯減少，見圖2。

2.4 各組細胞TGF-βR Ⅰ、TGF-βR ⅡmRNA 及Smurf2蛋白的表達比較 與C組比較，T組TGF-β1RⅡmRNA、Smurf2 蛋白表達上調（P＜0.05）；與T 組比較，T+B組TGF-β1RⅡmRNA表達上調，Smurf2蛋白表達下調，而T+M 組TGF-β1RⅠmRNA、Smurf2蛋白表達均下調，TGF-β1RⅡmRNA 表達上調（P＜0.05）；與 B 組比較，T+M 組TGF-β1RⅠmRNA 表達下調（P＜0.05）；與T+B 組比較，T+M 組TGF-β1RⅠ和TGF-β1RⅡmRNA 表達均下調（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

PD 是ESRD 患者的主要替代療法之一，目前全世界有超過272 000例患者接受PD治療［1］。中國國家腎臟病數據系統顯示，截至2017 年底我國PD 患者達86 264例［7］。腹膜纖維化發生的原因和機制復雜，作為腹膜結構基礎的間皮細胞發揮了重要作用。現代醫學主要采用預防腹腔感染、改善腹透液生物相容性、改進PD 技術等手段抑制腹膜間皮細胞EMT，防治腹膜纖維化，近年也有相關基因治療的報道[8]。部分單味及復方中藥具有抑制EMT、抗纖維化的作用，臨床用于慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）及ESRD 的治療。中醫藥抑制腹膜間皮細胞EMT，防治腹膜纖維化備受研究者的關注。研究表明，大黃素、丹參酮、黃芪甲苷、參芎注射液、腎康注射液等可改善由高糖腹透液誘導的大鼠腹膜功能減退及腹膜間皮細胞EMT，防治腹膜纖維化[9]。

Tab.3 Transcription levels of TGF-β1RⅠ and TGF-β 1RⅡmRNA and expression levels of Smurf2 protein in peritoneal mesothelial cells in five groups表3 5組腹膜間皮細胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡmRNA轉錄水平及Smurf2蛋白水平 （n=6，）

Tab.3 Transcription levels of TGF-β1RⅠ and TGF-β 1RⅡmRNA and expression levels of Smurf2 protein in peritoneal mesothelial cells in five groups表3 5組腹膜間皮細胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡmRNA轉錄水平及Smurf2蛋白水平 （n=6，）

組別C組T組B組T+B組T+M組F TGF-β1RⅠ mRNA 1.02±0.24 0.88±0.04 0.80±0.08 1.13±0.41 0.25±0.02bcd 7.435＊＊TGF-β1RⅡ mRNA 1.01±0.14 0.72±0.02a 1.01±0.39 1.53±0.13b 0.95±0.10bd 6.798＊＊Smurf2蛋白0.12±0.05 0.76±0.24a 0.69±0.26 0.28±0.07b 0.36±0.13b 7.454＊＊

PD 相關腹膜炎、腹膜透析液生物不相容性、高糖腹透液發生糖基化反應產生的糖基化終末產物等是導致腹膜間皮細胞EMT 的主要原因。其中TGF-β1 是目前公認的最強的促纖維化因子，TGF-β1 能促進上皮細胞EMT，還可以增加細胞外基質合成和減少細胞外基質降解，引起膠原沉積，加速腹膜纖維化。TGF-β1 需通過其受體TGF-βRⅠ和（或）TGF-βRⅡ而發揮作用。TGF-β1 先與TGF-βRⅡ結合形成復合物，之后TGF-βRⅠ再與形成的TGF-β1/TGF-βRⅡ復合物結合成聚合體形式，最終該聚合體進入細胞核發揮信號轉導作用[10]。TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smurf2 是腹膜間皮細胞EMT 中起重要作用的細胞因子。E-cadherin、ZO-1 是腹膜間皮細胞EMT的標志物，是上皮細胞側面表達的重要連接蛋白。在EMT 早期，E-cadherin、ZO-1 表達降低，是導致細胞融合變松散，直至細胞脫落的原因［11］。Smurf 是一種含E6 同源相關蛋白羧基端（Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus，HECT）結構域的E3泛素連接酶，通過選擇性地降解Smad 通路的關鍵組分，在調節TGF-β1 信號轉導中起著舉足輕重的作用［12］。Smurf2在TGF-β1信號活性調節中起樞紐作用，一旦功能失調，會導致一系列病理生理學改變［13］。Smurf2對TGF-β/Smads通路的調節是雙向的，既有正調節也有負調節作用，主要取決于通過WW結構域與不同蛋白結合以發揮不同作用。Smurf2與Smad2和Smad3直接結合誘導其降解發揮抑制作用。Smurf2還可以與Smad7結合使之發生泛素化降解，從而活化TGF-β1/Smad 信號通路［14］。Smurf2的雙向調節功能在維持TGF-β/Smads信號通路平衡中起了重要作用。因此，如何積極運用Smurf2 抑制通路的作用減少EMT 發生也是研究的重點。MG132是一種醛基肽類泛素-蛋白酶體抑制劑，能夠抑制細胞中不同類型蛋白酶的活性，從而阻斷靶蛋白的泛素化降解，目前在實驗研究中得到廣泛應用［15］。前期筆者課題組研究發現，一定濃度的扶腎方可通過調節尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表達抑制腹膜間皮細胞EMT，改善腹膜纖維化[16]。

本研究通過體外腹膜間皮細胞培養，觀察扶腎方對TGF-β1 干預的腹膜間皮細胞的E-cadherin、ZO-1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和Smurf2表達的影響。PD 相關腹膜纖維化細胞因子的研究主要采用高濃度葡萄糖腹透液誘導制備模型，上皮細胞轉分化模型則多采用TGF-β1干預腹膜間皮細胞制備［17］。本實驗采用40 μg/L TGF-β1 干預腹膜間皮細胞制備EMT 模型。研究顯示，TGF-β1 干預腹膜間皮細胞后，EMT 模型成功，E-cadherin、ZO-1mRNA 表達降低，而扶腎方含藥血清干預后則明顯增加E-cadherin、ZO-1mRNA 表達 。 模 型 組TGF-βR ⅡmRNA 表達明顯降低，扶腎方含藥血清可明顯上調TGF-βRⅡmRNA 表達。另外，本實驗采用MG132作為靶蛋白泛素化的抑制劑，經TGF-β1干預后，模型組Smurf2蛋白表達量明顯升高，而MG132干預后明顯下調，扶腎方含藥血清組Smurf2 蛋白表達也明顯下調，作用與MG132組類似。筆者推測扶腎方在TGF-β1 干預的腹膜間皮細胞EMT 模型中，通過上調TGF-βRⅡmRNA 表達，下調Smurf2蛋白含量，促進腹膜間皮細胞E-cadherin、ZO-1mRNA 表達，達到抑制腹膜間皮細胞EMT的作用。

傳統醫學認為，ESRD 的病機多為本虛標實證，本虛屬脾腎虧虛，標實表現為濕濁、瘀血，脾腎虧虛是濁、瘀產生的主因。患者PD治療后，仍不失ESRD病機關鍵，因此PD相關腹膜纖維化的主要病機仍為脾腎虧虛，濕濁瘀血內蘊。扶腎方是根據以上關鍵病機而配伍的臨床效方，由陳皮、半夏、黃芪、當歸、丹參、鬼箭羽、熟大黃、淫羊藿等組成，功效為“健脾益腎，化瘀降濁”，組方科學合理，融中醫“和、消、補”三法于一體，前期臨床研究及動物實驗表明，該方能改善腎功能，減輕PD 腹膜纖維化［5］，但目前離體細胞實驗靶點尚不明確。

綜上所述，本研究從體外細胞實驗初步證實，扶腎方可通過上調TGF-βR ⅡmRNA 表達，下調Smurf2蛋白含量，抑制腹膜間皮細胞EMT，達到防治腹膜纖維化的作用，為臨床應用扶腎方防治腹膜纖維化提供了實驗依據及理論支持，但扶腎方抑制腹膜間皮細胞EMT，防治腹膜纖維化是否還通過其他信號通路發揮作用還需進一步深入探索。