lncRNA HOST2通過PI3K/Akt途徑調(diào)控卵巢癌SKOV3細胞對順鉑的敏感性

韓建秋，郝麗惠，邢雅玲，張艷，吳維光

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，2018年全球新發(fā)病例超過29.5萬例，死亡病例超過18.4萬例［1］。2015年我國確診卵巢癌患者約52 100例，卵巢癌患者死亡約22 500 例。晚期卵巢癌患者在5年內(nèi)出現(xiàn)對鉑類化療藥物耐藥而復(fù)發(fā)的比例高達70%，是卵巢癌治療失敗的重要原因［2］。探索卵巢癌耐藥的分子機制，提高卵巢癌細胞順鉑敏感性成為當(dāng)前的研究熱點。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長度超過200個核苷酸的功能性RNA 分子，通常缺失開放性閱讀框，可導(dǎo)致原癌基因或抑癌基因表達失衡［3］。上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)錄因子2（HOST2）是一種在卵巢癌細胞中高表達的lncRNA［4］，參與乳腺癌［5］、肝細胞癌［6］、腦膠質(zhì)瘤［7］、胰腺癌［8］等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（Akt）信號通路是多種生長因子、細胞因子的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在卵巢癌細胞增殖及鉑類耐藥中起重要作用。目前有關(guān)卵巢癌細胞lncRNA HOST2 表達與PI3K/Akt 信號通路關(guān)系的研究報道尚少見。本研究應(yīng)用RNA 干擾（siRNA）技術(shù)，下調(diào)卵巢癌 SKOV3 細胞lncRNA HOST2 表達，探討 lncRNA HOST2 對卵巢癌SKOV3細胞順鉑敏感性的調(diào)控作用及相關(guān)機制，為提高卵巢癌化療敏感性提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人卵巢癌SKOV3細胞購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清、兔抗人IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物科技有限公司；注射用順鉑（10 mg）購自齊魯制藥；FITC-annexin V 凋亡試劑盒、RNA 提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、胰蛋白酶、總蛋白提取試劑盒購自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）試劑盒、CCK-8 試劑盒購自TaKaRa 公司；硝酸纖維素（PVDF）膜和蛋白Marker 購自美國NEB 公司。層流超凈工作臺、qPCR 儀（Bio-Rad 公司，美國），電泳儀（六一儀器廠，北京），臺式高速離心機（5415DR，Eppendorf公司，德國），CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SKOV3細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2 d 更換培養(yǎng)液，待細胞融合度達80%～90%時，用胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞，以1×106個/孔接種于6孔板，更換無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，待細胞貼壁生長至融合度為60%時進行細胞轉(zhuǎn)染。實驗設(shè)空白對照組、陰性對照組和siRNA 干擾組，其中空白對照組未進行轉(zhuǎn)染，陰性對照組和siRNA 干擾組SKOV3 細胞應(yīng)用Lipo?fectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA 和lncRNA HOST2-siRNA，按Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作。siRNA 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，lncRNA HOST2-siRNA 序 列 為 ：正 義 5'-GACUAAACAAGGU?CUUAAUTT-3'，反 義 5'-AUUAAGACCUUGUUUAGUCTT-3'；陰性對照siRNA 序列為：正義5'-UUCUCCGAACGUGU?CACGUTT-3'，反義 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。轉(zhuǎn)染6 h后更換RPMI1640完全培養(yǎng)基，48 h后進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μg，隨機引物1 μL，反應(yīng)緩沖液1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，dNTP 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL。轉(zhuǎn)錄條件為：65 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min。cDNA于-20 ℃儲存。

1.2.3 qPCR 法檢測lncRNA HOST2表達情況 應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，以 β-actin 為內(nèi)參照，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，序列見表1。反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，ddH20 7.0 μL，cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot 檢測PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白的表達 應(yīng)用蛋白裂解液，冰上裂解SKOV3 細胞10 min，提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。定量后取20 μg 上樣，進行 12%SDS-PAGE 凝膠電泳，分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂牛奶（50 g/L）封閉，洗膜，加入兔抗人一抗（1∶500稀釋）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋），ECL 發(fā)光壓片顯色，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參照，用Quantity One 軟件對PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt（S473）、p-Akt（S380）及 Bcl-2 條帶的光密度（OD）值進行分析。

1.2.5 順鉑作用于細胞 分別取3組細胞，無雙抗培養(yǎng)液重懸為單細胞懸液，體積為100 μL，按2×103個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換含順鉑濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞存活情況 應(yīng)用CCK-8試劑盒，取不同濃度順鉑作用后的96 孔培養(yǎng)板，按10 μL 每孔加入CCK-8液，培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上檢測450 nm處的OD值，每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值，計算3組不同濃度順鉑作用下的細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD 值-空白孔OD 值）×100%。應(yīng)用SPSS 17.0 軟件的Probit 程序計算半抑制濃度（IC50）。以細胞存活率為縱坐標(biāo)，順鉑濃度為橫坐標(biāo)，繪制細胞存活曲線。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 FITC-annexin V凋亡試劑盒取20 μmol/L 順鉑作用24 h 后的3 組細胞，胰蛋白酶消化，室溫下1 600 r/min 離心10 min，棄上清，預(yù)冷的PBS 液洗滌細胞2次，2 000 r/min離心8 min，棄上清，500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL的Annexin V和5 μL的碘化丙錠（PI）。震蕩混勻后采用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對卵巢癌SKOV3細胞lncRNA HOST2表達的影響 qPCR 結(jié)果顯示，siRNA 干擾組lncRNA HOST2表達水平（0.55±0.15）低于空白對照組（1.00±0.00）和陰性對照組（0.98±0.24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=5.217，P＜0.05）。

2.2 下調(diào)lncRNA HOST2 對卵巢癌SKOV3 細胞PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，siRNA 干擾組 p-Akt（S473）、p-Akt（S380）和Bcl-2 蛋白表達水平均低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；3 組Akt 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

2.3 下調(diào)lncRNA HOST2表達對順鉑作用下SKOV3細胞存活率的影響 CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，3 組細胞存活率均隨順鉑藥物濃度的增加而降低，見圖2。空白對照組、陰性對照組和siRNA 干擾組IC50分別 為（59.58±5.97）、（51.42±5.22）和（39.75±5.31）μmol/L，siRNA干擾組IC50明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=9.819，P＜0.05），見圖2。

Tab.2 Comparison of PI3K/Akt signal transduction pathway-related protein expressions between three groups表2 3組PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較（n=3，%，）

Tab.2 Comparison of PI3K/Akt signal transduction pathway-related protein expressions between three groups表2 3組PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較（n=3，%，）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較,b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組siRNA干擾組F Akt 55.72±3.42 58.43±4.13 51.69±4.26 2.202 p-Akt（S473）41.64±3.91 43.42±4.25 32.97±3.83ab 5.860＊p-Akt（S380）36.82±3.63 34.54±3.21 21.65±3.94ab 15.425＊Bcl-2 30.42±2.74 28.37±3.15 19.68±3.06ab 10.905＊

2.4 下調(diào)lncRNA HOST2表達對SKOV3細胞凋亡的影響 siRNA干擾組細胞凋亡率（12.42%±1.46%）明顯高于空白對照組（7.53%±1.25%）和陰性對照組（8.16%±1.31%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=11.753，P＜0.05），見圖3。

3 討論

迄今為止，人類基因組測序發(fā)現(xiàn)約98%的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為非編碼RNA，包括lncRNA 和微小RNA（microRNA）。lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其能夠在染色體修飾、基因組印記、轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)控下游基因的表達，進而導(dǎo)致細胞分化異常［9-10］。lncRNA HOST2 長度約為 2.9 kb，它是由 Rangel 于2003 年在卵巢癌細胞株和原位癌中發(fā)現(xiàn)的一種高表達lncRNA［11］。已有研究證實lncRNA HOST2參與卵巢癌細胞的增殖、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)過程［12］。

順鉑作為治療卵巢癌最常用的化療藥物之一，可與DNA 和非DNA 靶點結(jié)合，形成交聯(lián)及單加合物，從而阻斷DNA復(fù)制并誘導(dǎo)細胞凋亡。卵巢癌病死率位居婦科腫瘤之首，細胞耐藥是導(dǎo)致其高病死率的重要原因之一。Feng 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，抑制宮頸癌細胞lncRNA ZFAS1 的表達可增強其對順鉑的化療敏感性。本研究應(yīng)用siRNA 技術(shù)抑制卵巢癌SKOV3細胞lncRNA HOST2的表達，結(jié)果顯示，下調(diào)lncRNA HOST2表達后，3組細胞存活率均隨順鉑藥物濃度的增加而降低，而siRNA干擾組IC50明顯低于空白對照組和陰性對照組，SKOV3細胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組，提示抑制lncRNA HOST2 表達可增強SKOV3 細胞對順鉑的敏感性。檢測腫瘤細胞內(nèi)lncRNA HOST2 水平對于預(yù)估化療敏感性具有重要意義。

PI3K/Akt 信號通路是參與細胞增殖、凋亡及能量代謝的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路的活化與順鉑、阿霉素等化療藥物的耐藥密切相關(guān)［14］。Ma 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DANCR 可通過激活 PI3K/Akt 信號通路，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對順鉑的耐藥性。PI3K屬于磷脂激酶家族，是由一個P110催化亞基單位和一個P85調(diào)節(jié)亞基單位組成的異二聚體結(jié)構(gòu)。作為聯(lián)系細胞外信號與細胞應(yīng)答效應(yīng)的橋梁分子，PI3K能夠被許多細胞外因子激活。活化的PI3K 使二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）磷酸化成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），進一步激活A(yù)kt。激活的Akt從細胞膜異位到細胞質(zhì)和細胞核中，通過抑制或激活下游靶蛋白，進而參與調(diào)控細胞增殖、分化及血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞中Akt活化增加，激活的PI3K/Akt信號通路導(dǎo)致卵巢癌細胞耐藥及不良預(yù)后。抑制該通路能夠明顯減少卵巢癌細胞增殖，增加順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)lncRNA HOST2 后，卵巢癌 SKOV3 細胞中 p-Akt（S473）、p-Akt（S380）和Bcl-2 蛋白表達水平均明顯降低，提示沉默lncRNA HOST2 能夠抑制PI3K/Akt 信號通路的激活，從而增強SKOV3細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，lncRNA HOST2可通過PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控卵巢癌SKOV3細胞的增殖、分化及凋亡，抑制lncRNA HOST2 表達可增強SKOV3 細胞對順鉑的敏感性。