豬瘟檢測技術研究進展

但蕊桐 李虹霓 許靜 黃蘭香

摘 要：豬瘟是世界動物衛生組織 （OIE） 列出的16種A類傳染病之一，我國也將其列為一類動物疫病。本病致死性及傳染性極強，在給生豬產業造成巨大沖擊、影響群眾生活的同時，也給我國社會經濟和國際貿易造成巨大損失， 因此無論政府還是生豬養殖企業都一直把對豬瘟及時準確的檢測作為保證生豬產業健康發展的手段之一。本文作者通過查閱大量文獻資料，總結歸納了豬瘟檢測技術方面的發展現狀，以期為豬瘟高效準確的檢測提供技術參考，為豬瘟的有效防控提供理論依據。

關鍵詞：豬瘟;檢測;技術

豬瘟（CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的有囊膜的單股正鏈RNA豬瘟病毒（CSFV）[1]引起的高度接觸性、出血性豬傳染病。至今已經流行了70多年，是我國四大動物疫病之一。其主要流行特點是流行范圍廣，流行沒有明顯的季節性，發病豬年齡普遍較小，仔豬是主要的發病群體[2]。近年來豬瘟發病時的病癥更加溫和但發病持續時間較以往變得更長， 表現出持續性感染和混合感染[3]。目前已知的豬瘟病癥在臨床上可分為最急性型，急性型，慢性型，溫和型[4]。我國自新中國建立以來就一直重視豬瘟的防控工作，在這方面積累了相當的經驗，但通過疫苗接種控制豬瘟的策略近年來一直沒有達到理想的效果，在這種情況下，掌握敏感、高效、準確的豬瘟檢測技術尤為重要。本文就現有的豬瘟檢測技術種類及其優缺點進行綜述，為豬瘟的診斷技術提供參考。

1.分子生物學檢測

1.1 RT-LAMP

逆轉錄環介導等溫核酸擴增（RT-LAMP）是Notomi[5]等人在環介導等溫核擴增技術基礎上衍生出的一種能夠檢測RNA病原的新型檢測技術。優點是簡單便捷，不需要精密的儀器和特殊的試劑。原理是在原始環介導等溫核擴增反應中加入逆轉錄酶，通過對靶序列上的特異性引物和特殊DNA聚合酶的識別[6]從而對RNA進行擴增[7]。自陳蕾[8]于2009年研制出豬瘟RT-LAMP試劑盒，近年來RT-LAMP技術在豬瘟檢測領域被廣泛運用。曾小娜[9]等人的研究結果顯示此方法靈敏度高達10-5， 最低能檢測到1pg的RNA，反應快速可在1h內完成。且通過實驗可知RT-LAMP方法的靈敏度是RT-PCR的100倍，進一步證明了RT-LAMP方法的優越性。

1.2 RT-PCR

逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）是對病毒特異性基因進行擴增從而達到檢測目的。其優點是特異性好，敏感性高。波丹、黃憲高等人[10]于2000年對此方法進行了初探。RT-PCR可以擴增病毒的特異性核酸片段，從而解決豬瘟病毒和同屬病毒在血清學檢測中難以辨別的問題。初步肯定了RT-PCR特異性高的優點。后來的研究發現RT-PCR技術最低能檢測到100 pg微量的豬瘟病毒核酸[11]，進一步肯定了RT-PCR敏感性好的優點。陳創夫[12]等人采用了多種檢測方法對9份豬瘟病料進行了檢測。結果表明，用RT-PCR法檢測出的陽性率最高。但由于此方法對儀器和操作人員要求較高，需要高精確度 PCR 儀和裝備良好的實驗室條件，故對于基層檢測難以開展。

1.3熒光定量RT-PCR

熒光定量RT-PCR法的原理與普通的RT-PCR檢測大同小異，只是在其檢測過程中引入了熒光染料作為標記，再通過熒光PCR儀進行擴增[13]。雖然原理類似，但因為有了熒光染料的加入，使對目的擴增片段的識別更敏感、特異性更強，過程更迅速，結果更明顯。國外很早就將該法運用于豬瘟的定量檢測中[1]。余以剛黃韻[14]等人用熒光定量PCR的方法分別鑒別野毒株和疫苗株，其靈敏度達到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL，組內和組間變異系數均在0.7-2.2%之間，以上結果均顯示優于普通RT-PCR。王淑娟[15]等人用已知的35份疑似豬瘟病毒感染樣品，通過普通RT-PCR法檢出的陽性數量為21份，采用熒光定量RT-PCR法則檢出23份陽性，可知此方法檢出率更高。

1.4重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增檢測是由英國劍橋的NiallArmes等人[16]于2006年開發的一種可快速檢測的新型等溫核酸擴增方法，是近年來常用的豬瘟檢測技術。其基本原理是依靠一種能產生多種蛋白質活性的DNA代謝反應。所用引物寡核苷酸在重組酶的作用下插入和結合于DNA雙鏈互補序列中，再以類似于PCR的方式對DNA的特定區域進行指數擴增[17]。該法對于反應溫度、設備的要求較低，從而能更大限度的減少成本。且在低成本的前提下，反應時長也更短，5-30min內即可完成，靈敏度和特異性也相對更優[18]。根據王金鳳等人[19]的研究結果顯示，所建立的RT-RPA方法僅對豬瘟病毒有特異性擴增條帶，而對其他豬常見病原沒有特異性擴增結果。在57份臨床樣品的檢測中，RT-RPA方法的陽性檢出率為56.14%（32/57），而實時RT-PCR方法的檢出率為64.91%（37/57）。但由于至今仍然沒有專門用于RPA引物設計的軟件，只能靠大量的合成與篩選，在這方面的成本和時間消耗很大，有時甚至無法設計出理想的引物與探針，故該法的普及也有待進一步的研究發展。

2.免疫學檢測

2.1膠體金免疫層析抗體檢測

膠體金免疫層析技術是一種問世不久的能在體外進行的檢測技術，是在膠體金標記技術和免疫層析技術共同基礎上所創立[20]。一般可以分為兩大類[21]，其中GICA由于膠體金制備簡便，標記簡單純化也不復雜[22]。故自發現以來就得到了廣泛的應用。其主要原理是抗原抗體在固相膜上反應，然后用膠體金標記過的抗體進行顯色反應，來判斷是不是陽性。2004年姜建宏，周艷君等人[23]發現與ELISA相比， 膠體金免疫層析技術對人體危害小。王向鵬等人[20]對六種豬瘟診斷方法進行研究比較，選擇50 份樣品進行膠體金檢測，被檢測出的陽性占其中的16%，但病毒分離方法檢測出的陽性數量更多。說明其敏感性不足，故主要用于對畜群進行檢測，不適合個體檢測。

2.2雙抗體夾心ELISA

雙抗體夾心ELISA法是目前最常用的檢測豬瘟抗原的檢測方法之一，其原理是特異性抗體與待檢血清中的抗原，在固相載體上結合形成免疫復合物。洗去未結合的樣品之后加入酶標記抗體，與免疫復合物中的抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，再在酶反應底物的催化下反應，最后通過顯色反應，從而判斷抗原含量。湯賽冬，周雪芳等人[24]建立的夾心ELISA檢測方法，經過特異性和重復性的檢驗得出陽性結果符合率高達97.7%的結果。從而說明該方法有較好的特異性。雙抗夾心ELISA的豬瘟抗原檢測方法可直接檢測豬瘟病毒，對早中期的檢測都具有優勢[22]。該檢測方法不僅可以檢測新鮮組織和組織細胞培養物，而且對于檢測大批量的活動物血液樣品也極為適用，所以可運用于出入境檢驗檢疫[25]。但此方法操作時間較長（兩天），具有一定局限性[26]。

2.3 IPMA檢測方法

免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）其原理是在單層細胞中加入一抗和帶有HRP（辣根過氧化物酶）的二抗，最后再加入促進顯色反應的酶，通過光學顯微鏡觀察是否有特異性顯色反應來判斷陽性與否。根據張振倉魏麗娜等人[27]建立的豬瘟病毒IPMA檢測方法 的結果顯示，IPMA與RT-PCR和ELISA陽性檢測結果符合率均可達92%以上。且由譚斌[28]等人針對高致病性豬藍耳病毒發明的IPMA抗體檢測試劑盒也與其他病毒的參考血清無交叉反應，說明IPMA法具有良好的特異性和可靠性。但由于此方法得出的實驗結果容易受到個人主觀因素的影響，故并未廣泛應用。

3.結語

豬瘟作為世界各國重點關注和控制的豬的傳染病之一，對我國乃至世界范圍內養豬業影響極大，故自此病被首次發現以來，其檢測方法的研究一直為國內外學術界所關注，并成為一大研究熱點。目前關于豬瘟的檢測方法的研究呈現出良好的成果，已有的檢測技術對豬瘟的防控做出了巨大的貢獻。但不可否認的是這些檢測技術依舊存在一些局限性，目前廣泛用于豬瘟檢測的方法，普遍不能完全滿足快捷方便，特異型敏感性良好，耗材低廉的需求。近年來得益于國內外研究人員的努力，不少新型檢測方式逐步被建立創造出來，對豬瘟的檢測研究呈現出良好態勢。我們相信在未來會不斷涌現出更多滿足以上人們需求并能廣泛推廣于基層中的檢測方法。

參考文獻：

[1]G， R.， et al.， Diagnostic evaluation of a real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of classical swine fever virus. Journal of clinical microbiology， 2005（1）.

[2]涂長春， 中國豬瘟流行病學現狀與防制研究. 2004， 中國農業大學.

[3]徐佳， 豬瘟的流行病學、臨床癥狀、剖檢變化及防控措施. 現代畜牧科技， 2019（04）： p. 110-111.

[4]蘇雙， 張麗媛， and 劉欣， 豬瘟流行的新特點、臨床癥狀與剖檢變化. 獸醫導刊， 2009（10）： p. 30-31.

[5]T， N.， et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research， 2000（12）.

[6]肖斌， 朱永紅， and 鄒全明， 簡便敏感的環介導等溫擴增基因診斷新技術. 中華檢驗醫學雜志， 2005（07）： p. 761-763.

[7]Whiting， S.H. and J.J. Champoux， Properties of strand displacement synthesis by moloney murine leukemia virus reverse transcriptase： mechanistic implications 1 1 Edited by M. Gottesman. Journal of Molecular Biology， 1998（3）.

[8]陳蕾， 豬瘟病毒RT-LAMP快速診斷試劑盒的研制與應用. 2009， 中國獸醫藥品監察所.

[9]劉中勇， et al.， 豬瘟病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立. 中國畜牧獸醫， 2010. 37（06）： p. 71-74.

[10]羅廷榮， et al.， RT-PCR檢測豬瘟病毒初探. 廣西農業生物科學， 2001（01）： p. 17-20.

[11]謝志勤， et al.， RT-PCR檢測豬瘟病毒方法的建立與應用. 畜牧與獸醫， 2002（11）： p. 11-14.

[12]喬軍， et al.， 用RT-PCR法對豬瘟病毒檢測的研究. 塔里木農墾大學學報， 2001（04）： p. 25-27.

[13]祖立闖， et al.， 豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展. 養豬， 2016（06）： p. 117-118.

[14]余以剛， et al.， 豬瘟病毒野生株和疫苗株熒光RT-PCR鑒別方法的建立. 現代食品科技， 2013. 29（08）： p. 1978-1983.

[15]王淑娟， et al. 豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應用. in 中國豬業科技大會暨中國畜牧獸醫學會2015年學術年會. 2015. 中國福建廈門.

[16]Olaf， P.， et al.， DNA detection using recombination proteins. PLoS biology， 2006. 4（7）.

[17]Huimin， D. and G. Zhiqiang， Bioanalytical applications of isothermal nucleic acid amplification techniques. Analytica chimica acta， 2015. 853.

[18]施奕， et al.， 重組酶聚合酶擴增技術研究進展. 病毒學報： p. 1-11.

[19]王金鳳， et al.， 豬瘟病毒重組酶聚合酶擴增檢測方法的建立及應用. 中國獸醫科學， 2019. 49（06）： p. 687-693.

[20]王向鵬， et al.， 六種檢測豬瘟病毒方法的比較. 微生物學報， 2010. 50（08）： p. 1087-1093.

[21]張朝紅， 豬瘟四種實驗室診斷方法的比較研究. 2007， 西北農林科技大學.

[22]曹興萍， et al.， 雙抗夾心ELISA法及熒光抗體法檢測豬瘟抗原的應用與分析. 中國獸醫雜志， 2008（01）： p. 66-67.

[23]崔尚金， et al.， 豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測技術的建立和初步應用. 中國預防獸醫學報， 2005（03）： p. 213-217.

[24]湯賽冬， et al.， 檢測豬瘟抗原的夾心ELISA診斷試劑盒的制備、標化和應用的研究. 上海畜牧獸醫通訊， 2002（02）： p. 14-15.

[25]魚海瓊， et al. 應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗快速檢測豬瘟病毒. in 中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業委員會第7次學術交流會. 2002. 中國重慶.

[26]朱義霞， 用夾心ELISA方法檢測豬瘟病原. 河南畜牧獸醫， 2004（02）： p. 8-23.

[27]張振倉， et al.， 豬瘟病毒IPMA檢測方法的建立. 中國獸醫科學， 2018. 48（03）： p. 275-280.

[28]譚斌， et al.， PRRSV-IPMA抗體檢測試劑盒的研制及其應用. 中國獸醫科學， 2006（11）： p. 880-884.

作者簡介：

但蕊桐（1999-），女（漢族），重慶市渝北區人，本科生，動物醫學專業

李虹霓（2000-），女（漢族），重慶市沙坪壩區人，本科生，動物醫學專業

許靜（1997-），女（漢族），云南省蒙自市人，本科生，動物醫學專業

黃蘭香（1972-），女（漢族），湖南常德人，博士，任職于西南大學動物科技學院，副教授，研究方向：主要從事動物微生物學與免疫學的教學科研工作。

資助項目： 西南大學大學生創新創業訓練計劃項目（X201910635040）