高效液相色譜法測定桂枝茯苓丸制劑及含藥血清中芍藥苷、肉桂酸、丹皮酚

樊 暉，田 原，魏新智，王清華，付勇強，孫科峰

（遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

桂枝茯苓丸出自漢·張仲景《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁五味藥組成，主治婦人癥病下血。該方自宋以來被拓展用于治療婦科經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)、雜等血瘀諸癥，近十年來用于治療癥病（子宮肌瘤）等性激素依賴性疾病取得了較好的效果。因其療效確切，故為歷代方書所收載，《國家藥典》亦基本按原方的藥味組成、劑量配比、制法用量、主治功效進行收錄。為了對桂枝茯苓丸的配伍原理、有效成分及作用機制進行進一步研究，本實驗對桂枝茯苓丸制劑及含藥血清中的指標性成分進行了檢測，以建立高效液相檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DZF－250小型真空干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HS3120型超聲波清洗器；TD10001電子天平：浙江余姚金諾天平儀器有限公司。TG328B分析天平：上海天平儀器廠。低溫高速離心機：Heraeus Biofuge，28RS，德國生產(chǎn)。SANYO超低溫冰柜：MDF－382E，日本生產(chǎn)。美國Agilent1100高效液相色譜儀，G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1315柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測器 。

1.2 藥品與試劑

高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其它試劑為分析純，對照品丹皮酚（0708－9704）、肉桂酸（0786－9802）、芍藥苷（110736－200422），由中國藥品生物制品檢定所提供。桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁藥材購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，用粉碎機粉碎，過120目篩，備用。

1.3 動物

Wistar大鼠，雌性，體重180～220g，由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心購進，合格證號：SCXK（遼）2003－0016。顆粒飼料，由沈陽市于洪區(qū)前民動物飼料廠提供，合格證號：（遼）檢字001號。所有動物實驗前于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院SPF中心觀察1周后使用，合格證號：SYXK（遼）2004－0032。溫度22～23℃，濕度30%～50%。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品配制

桂枝茯苓丸的配制。高劑量：按等比例稱取桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁藥材粉末32.5g加蒸餾水至100mL混勻，備用。低劑量：按等比例稱取桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁藥材粉末16.25g加蒸餾水至100mL混勻，備用。

2.2 桂枝茯苓全丸制劑中芍藥苷、肉桂酸、丹皮酚測定

2.3.1 芍藥苷測定

測定方法：照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄VI D）測定。色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱，流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85），檢測波長：230nm，流速1mL／min，柱溫25℃。

對照品溶液制備：取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。

供試品溶液制備：取自制桂枝茯苓丸供試品適量，蒸干，取干膏精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，浸泡4h，超聲處理20min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

測定法：精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

結(jié)果：供試品在相同條件下檢出了芍藥苷，陰性液無干擾（見圖1、圖2）。

圖1 芍藥苷對照品HPLC色譜

圖2 桂枝茯苓丸供試品HPLC色譜

2.2.2 丹皮酚測定

測定方法：同芍藥苷。色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱流動相：甲醇－水（45：55），檢測波長：274nm，流速1mL／min，柱溫25℃。

對照品溶液制備：取丹皮酚對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。

供試品溶液制備：同芍藥苷。

結(jié)果：供試品在相同條件下檢出了丹皮酚，陰性液無干擾（見圖3、圖4）。

圖3 丹皮酚對照品HPLC色譜

圖4 桂枝茯苓丸供試品HPLC色譜

2.2.3 肉桂酸測定

測定方法：同芍藥苷。色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱乙腈-0.1%磷酸水溶液（25：75），檢測波長：285nm，流速1mL／min，柱溫25℃。

對照品：取肉桂酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.2mg溶液。

供試品：取自制桂枝茯苓丸供試品適量，蒸干，取干膏精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，浸泡4h，超聲處理20min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

結(jié)果：供試品在相同條件下檢出了丹皮酚，陰性液無干擾（見圖5、圖6）。

圖5 肉桂酸對照品HPLC色譜

圖6 桂枝茯苓丸供試品HPLC色譜

2.3 桂枝茯苓丸含藥血清中芍藥苷、肉桂酸、丹皮酚測定

2.3.1 含藥血清的制備

取雌性大鼠隨機分為空白組、全方高、低劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組每天按規(guī)定的劑量口服給藥，給藥體積為1mL／100g，空白組每日灌胃口服給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥7d。實驗進行到第8天大鼠（禁食16h）給藥后1h，從大鼠腹主動脈取血，以3000r／min，6℃冷凍，離心20min，取血清，備用。

2.3.2 丹皮酚測定

測定方法：照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄VI D）測定。

色譜條件：色譜柱：Diamonsil-C18柱，4.6mm×250mm，流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（35∶65），流速1mL／min，柱溫25℃，檢測波長：274nm。

對照品溶液制備：取丹皮酚對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。

供試品血清處理方法：取含藥血清0.1mL加0.2mL乙腈，渦旋混合1min，4000rpm離心5min，取上清液，過濾，備用。

測定法：精密吸取對照品溶液5μL與供試品溶液30μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

結(jié)果：含藥血清在相同條件下檢出了丹皮酚，陰性液無干擾（見圖7、圖8）。

圖7 丹皮酚對照品HPLC色譜

圖8 桂枝茯苓丸含藥血清HPLC色譜

2.3.3 肉桂酸測定

測定方法：照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄VI D）測定。

色譜條件：色譜柱：Diamonsil-C18柱，4.6mm×250mm，流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（35∶65），流速1mL／min，柱溫25℃，檢測波長：285nm。

血清處理方法：取含藥血清0.1mL加0.2mL乙腈，渦旋混合1min，4000rpm離心5min，取上清液，過濾，備用。

測定法：精密吸取對照品溶液5μL與供試品溶液30μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

對照品溶液制備：取肉桂酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.2mg溶液。

結(jié)果：供試品在相同條件下檢出了肉桂酸，陰性液無干擾（見圖9、圖10）。

圖9 肉桂酸對照品HPLC色譜

圖10 含肉桂酸血清HPLC色譜

2.3.4 芍藥苷測定

對含藥血清分別采用了乙酸乙酯萃取法、乙醚萃取法及甲醇沉蛋白方法，也嘗試了多種色譜條件，均未檢出芍藥苷。

3 結(jié)語

HPLC法是目前最常用的定性定量方法，結(jié)果可靠，重復性好，成本低廉。本實驗采用HPLC法檢測了桂枝茯苓丸中的指標性成分芍藥苷、丹皮酚、肉桂酸，并且對桂枝茯苓丸含藥血清中的三種成分進行了檢測，建立了檢測方法，為闡明桂枝茯苓丸組方的配伍原理、進一步深入研究桂枝茯苓丸的體內(nèi)作用機制奠定基礎(chǔ)。

桂枝茯苓丸含藥血清中未檢出芍藥苷成分，可能是由于芍藥苷在體內(nèi)代謝時間比較短，采血時濃度較低，HPLC的DAD檢測器未能檢出等多方面原因。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]李輝，任平，黃熙，等.高效液相色譜法同時測定健康人口服加味逍遙散后血清阿魏酸和芍藥苷含量及其藥動學研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2008（11）.

[3]孫言才 沈玉先 孫國平 屈建 陳禮明 魏偉反相高效液相色譜法檢測小鼠血清中丹皮酚濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2004（1）.