高原地區MS與基因測序對諾卡菌鑒定評價

巢世蘭 阿祥仁 張倩

【摘要】目的：以基因測序（16s rDNA、rpoB）為金標準，評價飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）對高原地區諾卡菌臨床分離株的準確性研究及病例分析。方法：回顧性調查我院2015.1-2019.12月，5年臨床標本中分離的16株諾卡菌，對比MS與測序的鑒定結果，將質譜法鑒定與基因測序法結果不一致的菌株維護進質譜數據庫;剔除病例缺如者，共收集13例。結論：高原地區分離的13株諾卡菌中，肺部依然是主要感染部位。

【關鍵詞】高原地區;MS;基因測序;諾卡菌

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究納入該院2015.1-2019.12診斷為諾卡菌感染患者病例13例（其中1株MS僅能鑒定到屬，與測序法結果不一致;維護MS菌庫后，將膿液諾卡菌通過自建庫功能添加至原菌庫）。并對兩種方法結果一致的13株菌進行臨床特點分析。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定

篩選出目標菌株，轉種哥倫比亞血平板，在35℃條件下孵育培養72h。

1.2.2 諾卡菌常規實驗室檢查方法：革蘭染色

弱抗酸染色為陽性、抗酸染色、鏡下菌體為長絲狀，菌絲常與菌體呈十字交叉。在培養基上36h后肉眼可見菌落，干燥白色或橙色菌落。

1.2.3 基因測序

使用TIANGEN TIAamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）制備細菌DNA。本研究采用的16s rDNA和rpoB擴增和測序方法是依照Carrasc研究中的引物和方法進行，16s rDNA擴增的正向引物和反向引物分別是5′-GCTTAACACATGCAAGTCG-3′和5′-GAATTCCAGTCTCCCCTG-3′，rpo B擴增的引物分別是5′-CGACCACTTCGGCAACCG-3′和5′-TCGATCGGGCACATCCGG-3′。PCR反應體系為25μL，包括：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5μL，上、下游引物共1μL，模板DNA 2μL，去離子水9.5μL。將擴增產物進行電泳分析及測通測序;測定序列在Genbank數據庫中運用BLAST程序進行比對分析。

1.2.4 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MS）

使用全自動快速生物質譜檢測系統IVD MALDI Biotyper，通過甲酸擴散法對所選13株菌株進行檢測并記錄數據。

2 結果

2.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法（MS）

應用MS鑒定諾卡菌的屬準確度為100%（13/13），種準確度為92.3%（12/13），其中1株僅能鑒定到屬與金標準不一致，詳見表1。

2.2 基因測序

瓊脂糖凝膠電泳顯示16s rDNA擴增產物大小約為1400bp，rpoB基因擴增產物大小約為400bp，與目標片段大小一致。將測定序列在Genbank數據庫中運用BLAST程序進行比對分析，比對結果見表1。

3 討論

本研究對 MS鑒定諾卡菌菌種的準確度與16s rDNA和rpoB基因測序金標準比較并進行了評估，結果為應用MS鑒定諾卡菌的屬準確度為100%（13/13），種準確度為92.3%（12/13），其中1例菌種鑒定結果與金標準不一致，且質譜評分較低1.436，說明鑒定結果可信度不高。將質譜法與基因測序法鑒定結果不同或無法鑒定到種的菌株維護進質譜菌種庫后，再次以甲酸擴散法鑒定不一致的菌株，可鑒定到種，且質譜評分較高1.906，說明鑒定可信度高[1]。因此，MS用于諾卡菌鑒定最主要的局限性是現有商品化數據庫中缺乏相應的圖譜，所以實驗室依據MS自建庫功能，完善相應數據庫，鑒定準確度可提高[2]。

基金項目：青海省創新平臺建設專項 （2018-SF-L3），青海省人民醫院院內課題

本研究納入的13例久居高原的患者，均患有可能導致免疫力低下的基礎疾病，最多見為肺部感染;其他可能導致免疫力低下的基礎疾病還包括2型糖尿病、慢性乙型病毒性肝炎、AIDS、腎病綜合癥感染等。

綜上，對于疑似諾卡菌感染的患者臨床醫師應及時多次送檢，以便提高陽性率，實驗室則應加強對諾卡菌種的鑒定能力，以指導臨床準確診治規范用藥。

參考文獻：

[1] 黃慧，陸志偉，徐作軍.諾卡菌感染26例臨床特點分析[J].中華結核和呼吸雜志，2010，33（9）：651-655. DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2010.09.005.

[2] 黃磊，張藝.諾卡菌分子鑒定方法的研究進展[J].檢驗醫學與臨床，2018，15（18）：2814-2817.