葫蘆巴種子提取物對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響??

黃小蕾 孫明振

摘 要：目的：探討不同溶劑萃取葫蘆巴乙醇提取液對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響。方法：利用MTT法檢測葫蘆巴乙醇提取物各層萃取物對MCF-7細胞的抑制作用，TUNEL法檢測對MCF-7細胞凋亡的影響。結果：高濃度（100μg/ml）萃取物對MCF-7有一定的抑制作用，其中正丁醇層萃取物抑制作用最強（77.65±0.57），凋亡率比對照組增加64.12%。結論：葫蘆巴乙醇提取物正丁醇萃取物有誘導MCF-7細胞凋亡的作用。

關鍵詞：葫蘆巴種子;提取物;乳腺癌;影響

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，已經成為女性健康的最大威脅。常規化療藥物的毒副作用和多藥耐藥性是成為化療失敗的主要原因。中草藥提取物在治療肺癌及減毒增效方面發展迅速，在治療肺癌方面有著巨大潛力。葫蘆巴為豆科葫蘆巴屬植物，是世界上最早的藥用植物之一。目前對葫蘆巴的研究已經表明其具有抗氧化[1]、抗糖尿病[2]、降膽固醇[3]、抗生育[4]、抗免疫、抗腫瘤[5]等作用。本實驗報道葫蘆巴種子醇提取物對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響。

1 材料

1.1細胞

人乳腺癌MCF-7細胞株，購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2藥物與試劑

葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）購買于國藥控股漯河有限公司，經鑒定為豆科植物蒙古葫蘆巴的干燥根。MTT、碧云天TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，購于鄭州天馳生物有限公司。

2 實驗方法

2.1藥物制備

取干燥的葫蘆巴藥材100g，粉碎至適宜粒度，用 1000mL75%乙醇滲漉提取，提取液減壓濃縮至無醇味，加水分散至100mL制成水混懸液。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有機層，得到4個部分：Ⅰ（石油醚層）、Ⅱ（乙酸乙酯層）、Ⅲ（正丁醇層）、Ⅳ（水層部分）。將提取的各個部分分別減壓回收溶劑至干，加適量95%乙醇溶解，再加蒸餾水稀釋（乙醇終濃度≤1.5%）制成實驗所需濃度的混懸液。

2.2細胞培養

將乳腺癌MCF-7細胞置于恒溫培養箱中（CO2濃度：5%，T：37℃），用RMPI 1640完全培養液（含10%胎牛血清和1%雙抗）培養，每天換液一次，換液前觀察細胞生長情況，平均2天傳代一次（觀察細胞貼壁生長至培養瓶的80%-90%左右即可傳代）。傳代方法：除去培養瓶中的培養液，用PBS液沖洗2-3遍后加入0.25%胰蛋白酶0.8ml，消化3-4分鐘，待消化完全后（細胞間隙變大，形狀變圓即為消化完全），立即加入RMPI164培養液終止消化，輕柔吹打貼壁細胞使其充分脫落后分裝，放入恒溫培養箱中繼續培養。

2.3 MTT檢測法

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，細胞培養版96孔板每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度至10000孔，邊緣孔用無菌PBS填充;5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物;5%CO2，37℃孵育48小時;每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h;終止培養，小心吸去孔內培養液;每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解;在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。上述實驗重復3次。計算公式：細胞生長抑制率（%）=[1-（實驗孔A值-對照孔A值）/對照孔A值]×100%。

2.4 TUNEL實驗

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，細胞培養板6孔板每孔加入2ml，鋪板使待測細胞調密度至1.6×106/孔。5%CO2，37℃孵育，待細胞貼壁。加入正丁醇層萃取物，孵育48H。PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛固定60分鐘;PBS洗滌1次，加入免疫染色洗滌液，冰浴孵育2分鐘，再用甲醇配制的0.3%過氧化氫溶液中室溫孵育20分鐘，PBS洗滌1次;配制生物素標記液，在樣品上加50μl生物素標記液，37℃孵育60分鐘，PBS洗滌1次，滴加0.1-0.3ml標記反應終止液，室溫孵育10分鐘。顯色，熒光顯微鏡下觀測。每個實驗組檢測200個細胞來判斷細胞凋亡情況。

2.5統計學處理

應用SPSS 17.0統計處理軟件進行統計分析，結果以 x±s表示，采用方差分析和t檢驗進行比較。P<0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 MTT法檢測葫蘆巴提取物對MCF-7的抑制作用

利用MTT法檢測葫蘆巴醇提物各層萃取物高（100μg/ml）、中（10μg/ml）、低（1μg/ml）三個濃度分別對MCF-7細胞的抑制作用。各層萃取物低中濃度對MCF-7細胞的抑制作用較弱，高濃度萃取物對MCF-7有一定的抑制作用，其中正丁醇層萃取物抑制作用最強。

結果如表1所示。

3.2 MTT法檢測正丁醇層萃取物對MCF-7細胞的抑制作用

利用MTT法檢測正丁醇層萃取物1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的抑制率。正丁醇萃取物對MCF-7細胞的作用呈劑量依賴性，利用SPSS17.0計算得出IC50為81.30μg/ml，結果如圖1所示。

3.3 TUNEL法檢測正丁醇萃取物對MCF-7細胞凋亡的影響

利用TUNEL法檢測正丁醇萃取物對MCF-7細胞凋亡的影響，實驗組細胞加入正丁醇層萃取物，終濃度為81.30μg/ml，孵育48h。與對照組相比較，實驗組凋亡率增加64.12%，結果如圖2、3所示。

4 討論

本研究利用MTT實驗及TUNEL實驗驗證了葫蘆巴種子醇提物正丁醇層萃取物對乳腺癌細胞MCF-7抑制及凋亡的影響。Mai等人研究證明葫蘆巴種子油對Vero、WISH、MCF-7、HEp2四種細胞均有抑制作用，其中對MCF-7和HEp2兩種細胞的作用最強[6]。Amr等人研究證明葫蘆巴提取物對有DMBA誘導Wistar大鼠乳腺癌腫瘤有抑制作用[7]。我們首先利用MTT檢測了葫蘆巴種子醇提物各層萃取物作用48h對MCF-7細胞的抑制作用，高濃度的各層萃取物對MCF-7細胞均有抑制作用，其中正丁醇萃取物的抑制作用最強。然后我們又單獨檢測了正丁醇萃取物對MCF-7的作用，結果顯示正丁醇萃取物對MCF-7的作用呈現劑量依賴性。為進一步驗證正丁醇萃取物對MCF-7細胞的抑制作用是由提取物誘導所引起的，我們又利用TUNEL實驗檢測了在正丁醇萃取物IC50（81.30μg/ml）作用48h后的凋亡作用，結果顯示，實驗組凋亡率比對照組增加64.12%，驗證了正丁醇萃取物能夠誘導MCF-7細胞凋亡。Rahmati等人研究證明，從葫蘆巴種子提取出的薯蕷皂苷元對肺癌細胞A549有抑制作用[8]。另有文獻報道葫蘆巴種子所含的番木瓜堿對淋巴樣白血病有顯著的活性，對小鼠肝癌（HAc）有明顯的抑制作用[9]。葫蘆巴提取物不同成分對癌細胞的作用不同，因此我們將進一步探索葫蘆巴種子提取物對乳腺癌作用的具體成分。

綜上所述，葫蘆巴種子醇提物正丁醇萃取物誘導MCF-7細胞的凋亡。

參考文獻

[1] Naidu MM， Shyamala BN， Naik JP， et al.Chemical composition and antioxidant activity of the husk and endosperm of Fenugreek seeds[J].Food Sci Tech Int，2011（44）：451-456.

[2] Kumar GS， Shetty AK， Sambaiah K， et al.Antidiabetic property of Fenugreek seed mucilage and spent turmeric in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Nutr Res， 2005（25）：1021-1028.

[3] Meghwal M， Goswami TK. A review on the functional properties， nutritional content， medicinal utilization and potential application of Fenugreek[J].J Food Process Technol，2012（3）：1-10.

[4] Bhalke RD， Anarthe SJ， Sasane KD， et al. Antinociceptive activity of trigonella foenum-graecum leaves and seeds （Fabaceae）[J].IJPT，2009（8）：57-59.

[5] Thomas JE， Manjula B， Lee EL， et al.Biochemical monitoring in Fenugreek to develop functional food and medicinal plant variants[J].New Biotechnology，2011，28（2）：110-117.

[6] Mai Mohammad Al-Oqail， Nida Nayyar Farshori， Ebtesam Saad Al-Sheddi， et al. In? VitroCytotoxic Activity of Seed Oil of Fenugreek Against Various Cancer Cell Lines[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2013（14）：1829-1832.

[7] Amr Amin，Aysha Alkaabi， Shamaa Al-Falasi， et al. Chemopreventive activities of Trigonella foenum graecum （Fenugreek） against breast cancer[J].Cell Biology International，2005（29）：687-694.

[8] Rahmati Yamchi Mohammad， Ghareghomi Somayyeh， et al.Diosgenin Inhibits hTERT Gene Expression in the A549 Lung Cancer Cell Line[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2013（14）：6945-6948.

[9] 荊宇，趙余慶.葫蘆巴化學成分和藥理作用研究進展[J].中草藥，2003，34（12）：1146-1149.