Chia-Pet技術與應用研究

許立

摘要：特定DNA調控元件之間的長距離染色質接觸在基因表達調控中起著關鍵作用，在理解信號網絡和細胞狀態時，必須對這些三維（3D）染色質結構中的相互作用進行全局表征。利用成對末端標記序列（Chia-Pet）進行染色質相互作用分析是一種將功能染色質結構轉化為數百萬個短標記序列的方法。自2009年開發以來，在染色質相互作用分析中具有獨特的優勢，從而為轉錄調控的研究提供了新的視角。本文介紹了Chia-Pet的實驗方案和數據分析過程，分析了幾種常用工具各自的特點和適用范圍，幫助研究人員選用合適的方法以獲得更可靠的結果。

關鍵詞： 基因表達調控; 三維染色質結構; Chia-Pet

【Abstract】 Long-distance chromatin contact between specific DNA regulatory elements plays a key role in gene expression regulation. Global characterization of the interactions in these three-dimensional （3D） chromatin structures is essential in understanding signal networks and cell states. Chromatin interaction analysis using Paired-End-Tag sequencing （Chia-Pet） is a method for transforming functional chromatin structures into millions of short labeling sequences. Since its development in 2009， it has unique advantages in chromatin interaction analysis， which provides a new perspective for the study of transcriptional regulation. This paper introduces the experimental scheme and data analysis process of Chia-Pet， analyses the characteristics and application scope of several commonly used tools， and helps researchers choose appropriate methods to obtain more reliable results.

【Key words】 ?gene expression regulation; three-dimensional chromatin structures; Chia-Pet

0 引 言

轉錄調控是真核生物中一個復雜而有序的過程，其中染色質相互作用起著關鍵作用，從而調節基因表達，并進一步影響其他細胞的活動。許多研究轉錄因子（tf）與轉錄調控的結合的技術已經被開發出來。例如染色質免疫沉淀（chip）微陣列（chip chip）[1]、chip pet[2]和chip seq[3]，但卻無法確定遠端tf結合位點的靶基因。另一個挑戰是確定這種遠端結合位點是否具有功能性，即通過染色體環在物理上接近靶基因啟動子，或吸引RNA聚合酶Ⅱ復合物進行基因轉錄。因此，鑒定全基因組遠端染色質相互作用，將調控元件引導至目標基因，可能為轉錄調控的研究提供新的視角。染色體構象捕獲（3c）[4]及其衍生物，4c[5-6]和5c[7]可以揭示參與轉錄調控的長程染色質相互作用，但這些技術受到限制，或者是因為其整體性較低，如3c，或者是因其無法在整個基因組中繪制高分辨率的相互作用區域[8]。染色質相互作用分析與配對末端標記測序（Chia-Pet）方法就能夠符合分析高吞吐量和高分辨率基因組水平上染色質相互作用這些要求。與HI-C[9]相比，Chia-Pet在與功能研究相關的蛋白質相關的更高分辨率上更好，確定TF結合位點和染色質相互作用，為以三維（3D）方式研究長程染色質相互作用奠定了堅實的基礎，并提供了更可靠的方式。目前，Chia-Pet已成功應用于人MCF7細胞[10]、人癌細胞[11]、人T細胞[12]、小鼠胚胎干細胞[13]、小鼠神經祖細胞[14]和小鼠B細胞[15]以及其他細胞[16]。

為了系統評價Chia-Pet的方法，本文將詳細探討該方法的實驗方案，與此同時，為方便后續研究分析，很多分析Chia-Pet數據的計算方法被提出，本文對這些計算方法進行了較為全面的研究與論述。

1 Chia-Pet實驗方案介紹

對端測序的結果存儲在2個fastq文件中，可以使用Chia-Pet工具[17]或其他方法[18]進行處理。通常，Chia-Pet數據處理有7個步驟（見圖1），分別是：連接子過濾;Pet映射;冗余去除;自連和互連Pet分類;結合位點分析自連Pet;用互連Pet進行染色質相互作用分析;染色質相互作用數據的可視化。

在第一步中，連接體將與參考半連接體核苷酸序列對齊。除標簽序列外，有2種半連接體，分別命名為A和B，而且具有相同的核苷酸。因此，根據連接體的組成將PET分為2類：相同的連接體（AA或BB）和不同的連接體（AB或BA）。然后將連接體從原始測序片段中排除，并保留剩余的DNA片段以供進一步分析。在連接體過濾后，使用BWA[19]、Bowtie[20]、Batmis[21]或其他繪圖工具將短DNA序列與參考基因組對齊。使用samtools[22]和bedtols[23]過濾掉冗余和低質量的映射序列。自連PET是指從兩端循環的單個DNA片段的測序片段，并在同一染色體上的短距離內映射到基因組。互連PET是指來自不同DNA片段的測序片段，通常2個標簽位于不同染色體中或長距離位于同一染色體中。雖然使用自連PET來確定基因組上的蛋白質結合位點，但是互連PET可以通過聚類來預測染色質相互作用。在此基礎上還須確保2個結合位點之間的交互集群確實存在或者是偶然發生的。Li等人[17]使用基于超幾何分布的Fisher精確檢驗來量化相互作用頻率。Paulsen等人[18]提出了一種基于非中心超幾何分布的新統計模型，該模型將基因組距離依賴關系考慮在內進行p值估計。最后，構建Chia-Pet瀏覽器來報告數據并可視化結合位點以及交互集群。

通過數據處理獲得的相互作用需通過濕實驗室進行驗證。短基因組距離中DNA元件間的相互作用可以通過3C實驗驗證。對于遠距離相互作用中的DNA片段（位于不同染色體或同一染色體中的兩個錨點，距離超過100萬堿基對），可以使用顯微鏡技術，如DNA熒光原位雜交（DNA-FISH）[24]直接觀察相互作用錨的位置和核中的相對空間距離。

2 Chia-Pet數據分析方法

2.1 Chia-Pet Tool介紹

正如預期的那樣，這種方法識別的交互要比CPT少得多。雖然這種方法能夠產生準確的交互，但是軟件只執行Chia-Pet數據分析、交互評分中的最后一步。因此，用戶必須編寫自己的軟件來查找和刪除鏈接器序列、對齊寵物、刪除重復項、調用峰值、將寵物分組到交互中并確定寵物距離的下限。因此，該軟件僅對具有重要編程技能的研究人員有用。已經描述了其他軟件包，但這些軟件包或者不公開，或者與CPT和Chiasig有類似的限制。

2.3 Mango介紹

Mango[25]將基因組位點間相互作用的可能性作為距離和峰深的函數進行建模，并使用該模型為相互作用分配統計置信度。值得注意的是，Mango用一種簡單而健壯的貝葉斯方法取代了計算上昂貴的距離匹配重布線方法。

由于使用方便和準確性的提高，Mango將通過對Chia-Pet數據集的分析，大幅提升揭示三維染色質結構特征和功能的能力。同時也糾正了非特定的相互作用，可以作為一個基因組接近和峰深的函數。本次研究證明，與CPT（現有的Chia-Pet分析管道）和Chiasig（為Chia-Pet交互提供統計置信度估計的軟件包）相比，Mango表現出更高的準確性。將Mango應用于多個Chia-Pet數據集，可以獨立復制與NAT相關的發現。三維染色質環的結構，包括對具有內向基序的CTCF結合位點的強富集。

除了提高準確性之外，Mango的可用性也頗受青睞。Mango被設計成所有的研究人員都可以使用。Mango很容易安裝，只需一個命令就可以完成從fastq到交互的所有步驟。

2.4 MICC介紹

MICC[26]，一種易于使用的R包，用于處理Chia-Pet數據。MICC旨在以高靈敏度檢測染色質相互作用，同時將錯誤發現率（FDR）控制在合理水平。 MICC的輸入是源自Chia-Pet數據的原始PET簇。 MICC的最終輸出包括：將PET簇描述為真實相互作用簇的后驗概率列表和相應的FDR。在不同數據集的相同FDR上，MICC總能檢測到比Chia-Pet工具和ChiaSig更多的相互作用。此外，MICC檢測到的相互作用在生物學重復之間也更加一致。

2.5 各種工具之間的性能比較

Mango僅依賴4個廣泛使用且易于安裝的軟件包。相比之下，CPT需要具體的操作系統配置，主要有復雜的編程語言和環境陣列，包括C、Perl、Python、R、 Mysql、Apache Web Server和Php，并附帶7頁的安裝指南。Chiasig可以輕松安裝，但只執行分析Chia PET數據所需的單個步驟。因此，用戶要編寫自己的代碼來執行大多數處理步驟，包括連接解析、PET映射、冗余去除、峰值調用和距離過濾，詳見表1。

MICC，從Chia-Pet的數據中檢測顯著染色質相互作用。與Chia-Pet工具相比，MICC使用較低深度的測序庫恢復了較高深度測序庫中檢測到的交互作用的顯著比例。同時，還為寵物集群提供了更一致的排序，從而可以提高實驗復制之間的再現性。通過與5C數據的比較，分析后發現MICC能比Chiasig更有效地檢測相互作用。此外，MICC檢測到的低PET計數的相互作用與5C數據有很大的重疊，這表明MICC尋找弱相互作用是可行的。這些特性使MICC優于其他現有的工具，特別是在以較少的排序深度處理ChiaPET數據時。

3 Chia-Pet技術應用

3.1 研究DNA片段之間的相互作用

Chip Seq用于分析DNA和蛋白質之間的相互作用，而Chia-Pet則從根本上研究DNA片段之間的相互作用。Fullwood等人[27]使用Chia-Pet技術構建了由人乳腺癌細胞系MCF7的雌激素受體α（ER-a）結合的染色質相互作用網絡，發現長程ER-α結合位點主要位于啟動子區域。Handoko等人[28]發現CTCF介導的小鼠胚胎多能干細胞相互作用。Chia-Pet揭示的5個不同的染色質結構域為染色體結構組織提供了新的CTCF功能模型，并將增強子與基因轉錄調控的啟動子連接起來。

在描述人類T細胞中增強子-啟動子相互作用后，Chepelev等人[29]提出增強子以細胞特異性的方式增加其靶基因的表達，相互作用的啟動子是共存的。此外，細胞核中的染色體在多個層次上被組織起來發揮作用，除CTCF外，還有許多因素可能參與T細胞的這一過程。在未來的研究中，需要對詳細的機制進行探討。

He等人[30]根據Chip Seq獲得的ER-α結合峰計算DNA環化的可能性，繼而預測ER-α介導的染色質相互作用。這是第一個使用Chip Seq預測染色質相互作用的工作，為Chia-Pet提供了補充。

3.2 構建染色質相互作用網絡

與許多細胞網絡一樣，染色質交互網絡[31]具有無標度和模塊化拓撲結構，多數節點僅參與一個或兩個交互，而一些節點與不成比例的大量節點連接。染色質相互作用網絡被組織成“社區”，社區內的基因以協調方式執行相關功能并對外部刺激做出反應，意味著這些社區可能在數百萬年進化過程中被塑造。

在未來的研究中，不僅可以將該方法應用于其他特定類型的基因，還可以將相互依賴的網絡結合起來，因為細胞活動一起發生并且相互聯系。 此外，染色質相互作用網絡可能奠定3D或甚至4D基因組波的基礎，從靜態轉變為動態[31]。

3.3 染色質相互作用的功能研究

目前，已有多種方法用于研究Chia-Pet鑒定的染色質相互作用的功能，即：熒光素酶報告基因測定[11]、目的蛋白的表達水平敲定實驗[11]、來自轉基因實驗的增強子測定法鑒定的調控元件[15]、基因組編輯方法（如鋅指核酸酶基因組編輯，TALENs和CRISPR / Cas9）干擾染色質相互作用[16]。

3.4 染色質三維結構的重建

染色質的精確三維結構提供了更好的生物學功能景觀。到目前為止，遠距離相互作用的數據適合于重建三維基因組結構。2個3c衍生物，即hi-c[10]和Chia-Pet[9]，實際上反映了整個基因組的結構。Hi-C技術可以捕獲所有的交互，但是分辨率很低。Chia-Pet技術大大提高了分辨率，但只能識別已知蛋白質介導的相互作用。因此，Chia-Pet數據可用于進行更為密集的建模。

對染色質的三維結構進行建模主要有2種方法[32]。一種是物理模型，如用于解釋實驗結果的珠子串模型;另一種是用于重建結構的非線性優化模型。其中，物理模型方法中必須考慮許多物理性質。重建結構的非線性優化模型的第一步是將染色質相互作用頻率轉換為空間距離，基于此將空間距離轉換為三維結構。由于缺乏直接參數來評估在全基因組范圍內建立的三維結構，電子顯微鏡的發展將在促進染色質三維結構的研究中發揮重要作用。染色質相互作用的可視化與功能測定結合是一種重要的方式，可以讓人們對基因組結構有更直觀的印象，并全面了解基因組的功能。

4 結束語

本文介紹了Chia-Pet的實驗方案和數據分析過程，分析了幾種常用工具的特點和適用范圍，有助于研究中選用合適的方法以獲得更可靠的結果。現已成功地應用于轉錄調控分析的許多研究中，并已鑒定出不同的染色質相互作用模型。盡管如此，在Chia-Pet協議和分析管道方面仍有亟待改進之處，使協議更加簡潔和易于執行，數據分析過程更加自動化和可定制。

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