多層紙芯片培養體系研究外泌體介導的乳腺癌細胞-肺成纖維細胞相互作用

林諄 陳曉 林冬果 劉大漁

摘?要?采用多層紙芯片共培養體系研究了外泌體介導的乳腺癌細胞-肺成纖維細胞相互作用。多層紙芯片體系包含接種乳腺癌細胞成份的腫瘤層，接種肺成纖維細胞的招募層，以及上述兩層之間的侵襲層。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細胞和肺成纖維細胞的三維共培養體系，而拆解多層紙芯片則逐層檢測細胞，因而可以從時間和空間角度解析細胞間相互作用。研究了在腫瘤層接種乳腺癌細胞或固定乳腺癌細胞來源的外泌體，發現二者同樣可以誘導招募層的肺成纖維細胞轉化為腫瘤相關成纖維細胞。之后，在招募層種植外泌體誘導的腫瘤相關成纖維細胞，其顯示出較原生細胞更強的乳腺癌細胞招募作用。研究結果表明，轉移前微環境的形成主要在于腫瘤外泌體介導的宿主器官成纖維細胞轉化，而宿主器官微環境的改變反之招募腫瘤細胞定向遷移。

關鍵詞?紙芯片;乳腺癌;成纖維細胞;外泌體;共培養;轉移前微環境

1?引 言

腫瘤轉移具有明顯的器官選擇性[1，2]，其中一個重要原因在于腫瘤細胞與宿主器官之間存在信息交流，從而引發宿主器官形成轉移前微環境，后者促進腫瘤細胞的轉移性種植[3，4]。近期的大量研究顯示，外泌體是腫瘤細胞與外界進行信息交流的重要媒介[5]。外泌體來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中，其成分包含復雜RNA和蛋白質。外泌體在腫瘤轉移中發揮了重要作用，尤其是可以改造遠端臟器細胞，進而誘導腫瘤細胞遷移和定植[6]。因而，研究外泌體介導的腫瘤定向遷移對于腫瘤轉移機制和轉移干預研究具有重要價值。鑒于播散的腫瘤細胞中只有少部分能夠在轉移前微環境中存活并形成腫瘤[7，8]，通過宏觀水平解析外泌體介導的腫瘤遷移具有極大的難度。因此，迫切需要發展能夠以簡單的手段研究外泌體介導的腫瘤-遠端臟器的動態相互作用的腫瘤轉移模型。

目前，用于研究腫瘤轉移的模型主要包括動物水平和細胞水平兩類。相較于動物模型，細胞水平腫瘤轉移模型能夠更直接和清晰地反映細胞遷移行為[9～13]。例如，經典的Transwell實驗是利用包含多孔薄膜的裝置檢測腫瘤細胞的跨膜遷移行為。然而，Transwell實驗有一些限制，包括使用二維培養細胞，不能仿真腫瘤細胞的體內結構形式;由于擴散效應，跨膜化學環境差別難以長期維持;無法研究腫瘤細胞在遷移過程中的動態變化。鑒于外泌體介導的腫瘤-遠端臟器動態相互作用是一個長期過程，因而，相關研究需要一種既可長時間保持微環境穩定性，又能夠動態解析細胞-微環境相互作用的研究工具。

紙基微流控芯片是構建細胞仿生環境的有利工具。紙是一種具有多孔結構的生物兼容性材料，可作為支架實現三維細胞長期培養[14，15]。此外，借助于圖形化加工獲得的紙芯片可以實現多區域細胞培養，能夠實現高通量細胞分析[16～18]。紙芯片可以進一步疊加，構建更為復雜的細胞培養體系。這類多層紙芯片被嘗試用于腫瘤細胞-微環境相互作用研究，并顯示出獨特的優勢：可以將含有不同微環境組分的紙張堆疊起來，充分再現微環境的復雜性[14，16];多層疊紙結構允許信號分子的交流，并能長期保持化學濃度梯度[19，20]。這種非血管結構可以簡便地形成復雜的化學濃度梯度，為細胞相互作用研究提供有利條件;拆分多層疊紙結構可以將從特定層回收的細胞對應遷移過程中的特定階段，有助于從時間和空間角度解析細胞-微環境相互作用。基于以上優點，多層紙芯片培養體系是研究外泌體介導的腫瘤細胞-微環境相互作用的有力工具。

本研究設計了一種多層紙芯片培養體系，用于研究外泌體介導的乳腺癌細胞-肺成纖維細胞相互作用。多層紙芯片由腫瘤層、侵襲層和招募層組成，其中，腫瘤層接種乳腺癌細胞或固定乳腺癌細胞來源外泌體，招募層接種肺成纖維細胞，侵襲層將這兩層分隔。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細胞和肺成纖維細胞的三維共培養體系，而拆解多層紙芯片則可以逐層檢測細胞。利用此多層紙芯片工具，分析共培養體系內不同層面上細胞的形態、結構和功能，從時間和空間角度解析外泌體介導的腫瘤細胞-宿主器官相互作用。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Optima XPN-80 超速離心機（美國Beckman公司）;SZ-100Z納米顆粒分析儀 （法國HORIBA公司）;JEM-1400plus掃描電鏡（日本JEOL公司）;IX71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;Ti-E A1共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

PBS、DMEM 培養基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液、細胞核染料DAPI、鈣黃綠素/AM（Calcein/AM）、鬼筆環肽（Phalloidin）（美國Thermo Fisher公司）;α-SMA一抗、Vimentin一抗（美國Abcam公司）;FITC熒光標記二抗（武漢博士德公司）;胎牛血清（美國Sigma公司）;多聚甲醛、海藻酸鈉（上海生工公司）;CaCl2（羅恩公司）;BCA試劑盒（江蘇碧云天公司）;人肺成纖維細胞株HLFs來自中山大學;乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MDA-MB-453來自中國科學院上海細胞生物研究所。

2.2?紙芯片的加工

紙芯片使用Whatman 105擦鏡紙以蠟染方法加工[21]。單張紙芯片尺寸為8 cm×3 cm，包含10個蠟染疏水屏障封閉的圓形親水區，親水區直徑8 mm，間隔8 mm。圖形化紙片在150℃下烘烤10～15 s，將蠟融化并滲透到紙全層。之后，紙片在乙醇浴中消毒30 min，在層流罩中經紫外線照射后，風干。

2.3?細胞培養

人乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞、HLFs用DMEM完全培養基（含10%胎牛血清），在37℃、5% CO2條件下常規培養。回收的細胞重懸于含2%海藻酸鈉的DMEM培養基中，備用。

2.4?外泌體的提取與鑒定

培養至第三天，收集乳腺癌細胞培養液，500 r/min離心10 min，取上清液，12000 r/min離心20 min，去除凋亡小體和細胞碎片，上清液以120000 r/min離心70 min，獲得外泌體。將外泌體用20 mL PBS清洗后，再次超速離心，收集的外泌體用PBS重懸，進行掃描電鏡檢測，并用納米粒子分析儀進行粒徑分析。使用BCA試劑盒測定外泌體濃度。

2.5?外泌體處理肺成纖維細胞

HLFs以50000細胞/孔的密度接種于六孔板中，每孔添加10 μg/mL 乳腺癌細胞來源外泌體。每3天補充1次培養基。

2.6?多層紙芯片共培養體系的構建

紙芯片上的細胞培養步驟：（1）將細胞重懸于2%海藻酸鹽-DMEM溶液，以106細胞/mL密度接種于紙芯片親水區，每個區域約5000個細胞;（2）向接種區加入40 mmol/L CaCl2溶液，靜置2 min，形成海藻酸鈣凝膠;（3）接種細胞的紙芯片置于含DMEM的培養皿中，于5% CO2培養箱中37°C孵育過夜;（4）將各層紙芯片按照順序組裝。如圖1所示，多層紙芯片培養體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層。腫瘤層接種MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌細胞或上述細胞來源的外泌體，招募層接種HLFs，兩層之間由侵襲層隔開，親水區域為不含細胞的海藻酸鈣凝膠。此外，招募層和鄰近的侵襲層之間插入一層PC膜，防止腫瘤細胞進入招募層。多層紙芯片由定制的聚四氟乙烯夾板固定。組裝完成后，多層紙芯片頂層夾板的開孔處加入DMEM溶液，裝置于37℃、5% CO2培養箱中孵育培養，每天換液。

2.7?芯片上的細胞檢測

培養3天后，拆卸紙芯片裝置，將每層紙芯片各置于單獨的培養皿中，以PBS清洗2遍，37℃下Calcein-AM 染色孵育10 min。紙芯片置于倒置顯微鏡下拍攝，熒光圖像用Image J軟件分析。細胞分布計算公式為Fi/Ft×100%，其中，Fi為某層某親水區的熒光強度，Ft為各層同一位置親水區熒光強度之和。

2.8?細胞免疫熒光分析

拆解的單層紙芯片置于培養皿中，以4%多聚甲醛固定，室溫孵育20 min，以PBS沖洗3次后，用4% BSA封閉。招募層紙芯片細胞培養區用抗α-SMA 一抗（1：500稀釋） 和抗 Vimentin一抗 （1∶500 稀釋）于4℃孵育12 h，再用FITC二抗標記，37℃孵育1 h。細胞核用1 μg/mL DAPI染色。紙芯片用PBS沖洗3次后，置于共聚焦顯微鏡下拍攝，熒光圖片用Image J軟件分析。

3?結果與討論

3.1?多層紙芯片培養體系的構建

為研究外泌體介導的腫瘤-遠端臟器動態相互作用，構建了一種多層紙芯片培養體系。多層紙芯片培養體系的優勢在于既可通過組裝獲得包含復雜微環境的培養體系，又可通過拆解獲得每個層面上的細胞信息。本研究設計的多層紙芯片的每層含有10個親水區域，因而允許進行平行的細胞-微環境相互作用研究。多層紙芯片培養體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層（圖2），并在招募層和鄰近侵襲層之間插入一層多孔PC膜，以防止侵襲層和招募層之間的細胞串擾。

將這種多層紙芯片共培養體系用于外泌體介導的乳腺癌-肺相互作用研究。多層紙芯片體系中，接種乳腺癌細胞的腫瘤層模擬原發乳腺癌，接種HLFs的招募層模擬肺，兩層之間的數層侵襲層模擬腫瘤細胞的轉移途徑。完成培養后，將多層紙芯片拆解，不同層面紙芯片對應細胞遷移的不同階段。逐一分析不同層面上細胞的形態、結構和功能，可以從時間和空間角度解析外泌體介導的腫瘤細胞-宿主器官相互作用。侵襲層中出現腫瘤細胞是腫瘤遷移的證據，由培養條件對腫瘤遷移的影響可以獲知微環境因素在腫瘤轉移過程中發揮的作用。

這種多層紙芯片培養體系為研究外泌體介導的研究乳腺癌細胞-HLFs相互作用提供了有利的工具：一方面，將乳腺癌細胞來源外泌體固定于腫瘤層，觀察其對HLFs的轉化作用;另一方面，在招募層種植外泌體誘導的腫瘤相關成纖維細胞，觀察其對乳腺癌細胞招募作用。借助于多層紙芯片培養體系，從時間和空間角度解析外泌體介導下轉移前微環境的形成及其對腫瘤轉移的影響。

3.2?紙芯片上的乳腺癌細胞與肺成纖維細胞的共培養

將乳腺癌細胞（MDA-MB-231和MDA-MB-453）置于腫瘤層，將HLFs置于招募層，將芯片組裝后培養。為了更好地模擬體內條件，將腫瘤層置于底層缺氧環境，將招募層置于頂層富氧環境。共培養結束后，拆解多層紙芯片，用死/活細胞熒光染色標記各層紙上的細胞。結果表明，不同紙層上的細胞活性良好（圖3A）。

與單獨培養相比，乳腺癌細胞-HLFs共培養條件下HLFs細胞活性無明顯變化（圖3B），而乳腺癌細胞的活性則有所提高（圖3C）。此結果表明，多層紙芯片不僅能夠提供充足的氧氣和養分，還可通過細胞間相互作用提高腫瘤細胞的活性。

3.3?乳腺癌細胞來源的外泌體激活肺成纖維細胞

研究了多層紙芯片共培養體系中腫瘤層和招募層細胞之間的相互作用。與文獻[22]報道相似，本研究同樣觀察到腫瘤細胞通過旁分泌效應促進成纖維細胞轉變成腫瘤相關成纖維細胞。在紙芯片共培養體系中，將腫瘤層置于中間層（L3），招募層位于頂層（L6），在共培養不同時間后，檢測HLFs的波形蛋白（Vimentin）的表達情況。與不同乳腺癌細胞共培養的兩組實驗中，HLFs中波形蛋白表達隨培養時間延長而增加（圖4）。此結果表明，原發癌灶的腫瘤細胞參與宿主器官轉移前微環境的形成，而此過程具有時間依賴性。

鑒于外泌體是腫瘤細胞與其它細胞信息交流的一個重要途徑[23]，進一步研究了外泌體在肺成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞轉化過程中發揮的作用。制備并確認了乳腺癌細胞來源外泌體（圖5A），并將純化得到的外泌體固定在多層紙芯片的腫瘤層，與HLFs共培養。免疫熒光檢測結果表明，培養后的HLFs中，波形蛋白和α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達均增高（圖5B），說明外泌體誘導了HLFs轉變成CAFs。因此，可以認為外泌體的傳輸是形成腫瘤轉移前微環境的一個重要途徑，其主要作用在于誘導腫瘤相關成纖維細胞的形成。

3.4?腫瘤相關成纖維細胞誘導的乳腺癌細胞定向遷移

為了研究來自宿主器官的招募效應對乳腺癌細胞的影響，檢測了向招募層轉移的乳腺癌細胞數量。將腫瘤層置于底層（L2），招募層置于頂層（L6）。利用Calcein-AM染色檢測各層的細胞密度，進而表征細胞在共培養體系中的分布情況。MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞都向招募層遷移，侵襲層的細胞密度顯示招募作用的強弱。實驗發現，大部分乳腺癌細胞都轉移至第4層和第5層。與HLFs共培養時，有40.97%±6.56% 的MDA-MB-453 細胞和19.86%±2.57% MDA-MB-231細胞遷移到侵襲層;與CAFs共培養時，MDA-MB-453細胞的遷移比例增長到62.97%±4.95%，而 MDA-MB-231細胞提高到44.97%±2.74%（圖6）。細胞遷移結果表明，CAFs在促進腫瘤轉移過程中起著重要的作用，而CAFs又是由外泌體誘導HLFs形成。由此得出，在腫瘤的轉移過程中，腫瘤細胞分泌的外泌體誘導HLFs轉變成CAFs，形成轉移前微環境;CAFs招募腫瘤細胞轉移至宿主器官。因此，多層紙芯片的共培養體系是研究腫瘤細胞和宿主器官細胞相互作用的有力工具。骨細胞、神經細胞、肝細胞等其它細胞也可置于招募層，利用多層紙芯片模型可研究腫瘤不同器官定向遷移的機制。

4?結 論

設計的多層紙芯片共培養體系具有以下特性： 便于加入不同類型的細胞用于研究腫瘤與宿主遷移的相互作用;基于紙層堆疊形成的共培養方法能夠模擬體內微環境;拆解多層紙芯片允許從時間和空間上研究細胞間相互作用。基于以上優勢，這種多層紙芯片共培養體系是腫瘤器官傾向性轉移機制研究的有利工具。利用此多層紙芯片共培養體系研究了外泌體介導的乳腺癌細胞-HLFs相互作用。一方面，乳腺癌細胞分泌外泌體誘導肺成纖維細胞轉化為腫瘤相關成纖維細胞;另一方面，外泌體誘導產生的腫瘤相關成纖維細胞反過來招募乳腺癌細胞。基于多層紙芯片共培養體系的細胞相互作用，研究證實了原位腫瘤細胞可通過外泌體誘導轉移前微環境的形成，從而促進腫瘤細胞的定向遷移。

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