miR-31-5p對胰島β細胞增殖及2型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響

熱孜萬古麗·烏斯曼 沙依拉·海米提 郭艷英

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，在世界范圍內較為常見，且近年來發生率越來越高，嚴重威脅著人類的健康和生活質量[1～3]。糖尿病主要發病機制有糖脂代謝異常、胰島素抵抗、氧化應激、炎性反應等[4]。葡萄糖代謝紊亂是糖尿病癥狀中最突出的表現，從胰島中產生和分泌的胰島素對于維持葡萄糖穩態起著十分關鍵的作用[5]。胰島由多個內分泌細胞組成，主要包括α、β、δ和PP細胞，胰島內分泌細胞中胰島β細胞占60%～80%，其能夠分泌并釋放胰島素[6]。胰島素是一種合成代謝激素，可增加細胞對血糖的吸收，從而降低血糖水平，而胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙是2型糖尿病的兩個主要病理與生理學特征[7]。

微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～24 個核苷酸的非編碼低分子單鏈RNA，主要通過與靶基因mRNA 3′UTR 端結合來發揮作用，可以通過翻譯抑制或降解其靶mRNA來調控相關基因的表達[8,9]。大量研究表明，miRNA廣泛存在于組織和器官中，并且在多種疾病的發生與發展過程中起到調控作用[10]。已發現許多轉錄因子和miRNA可調節胰島功能，miRNA在調控胰島素的分泌和抵抗、葡萄糖水平等方面均發揮重要作用[11～13]。本研究通過抑制或過表達MIN6細胞中miR-31-5p來檢測其對細胞增殖以及胰島素分泌的影響，并建立2 型糖尿病小鼠模型，通過給予尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC和miR-31-5p inhibitor來觀察小鼠胰腺組織變化，探討miR-31-5p在2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗中的作用。

材料與方法

1.主要與材料：主要試劑與材料：MIN6小鼠胰島細胞株購自上海博谷生物科技有限公司，小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒購自美國ALPCO公司，LipofectamineTM2000、CCK-8試劑盒、HE染色試劑盒購自上海碧云天生物公司，鏈脲佐菌素和TRIzol試劑購自美國Simga公司，All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒、All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，基礎飼料與高脂高糖飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，兔抗胰島素、兔抗Cleaved Caspase-3與HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司。80～90日齡的SPF級C57BL/6J小鼠由新疆醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號: SCXK(新)2018-0002。

2.細胞培養：將MIN6小鼠胰島細胞株置于含10%胎牛血清、100μg/ml慶大霉素、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640培養基中，放在37℃、5% CO2細胞培養箱內進行培養，待細胞覆蓋率達80%～90%時，棄去培養基，用無菌的PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞5min，進行傳代培養。

3.細胞轉染：將MIN6細胞按照每孔 2×105個接種至 6 孔細胞板上，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育過夜。實驗分為Blank組(空白對照組)、miR-31-5p mimic 組(轉染 miR-31-5p mimic)、miR-31-5p mimic NC 組(轉染miR-31-5p mimic陰性對照)、miR-31-5p inhibitor組(轉染miR-31-5p inhibitor)、miR-31-5p inhibitor NC組(轉染miR-31-5p inhibitor陰性對照)。miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor及miR-31-5p mimic/ inhibitor NC片段均由廣州銳博生物公司設計并合成。Blank組正常培養不進行轉染。根據轉染試劑LipofectamineTM2000 說明書操作，將Lipofectamine 2000分別與50nmol/L miR-31-5p mimic、100nmol/L miR-31-5p inhibitor和50nmol/L miR-31-5p mimic/inhibitor NC轉染至MIN6細胞中，于37℃、5% CO2培養箱中轉染4h后，更換新鮮RPMI1640培養基繼續培養48h，收集各組細胞進行后續實驗。

4.qRT-PCR：使用TRIzol試劑提取轉染后各組MIN6細胞，采用核酸蛋白檢測儀Nanodrop測定提取的RNA純度和濃度。以All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒進行擴增，以U6作為內參基因，擴增體系為：All-in-One qPCR Mix 10μl, cDNA 2μl, All-in-One miRNA qPCR Primer 2μl, Universal Adaptor PCR Primer 2μl, 50×ROX Reference Dye 0.5μl, 無酶水3.5μl。擴增條件為： 95℃預變性10min，95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 10s，共40個循環。使用的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：miR-31-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGGCAAGA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′； U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

5.CCK-8：將成功轉染的各組MIN6細胞1×105個/孔接種至96孔板，分別在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養 0、12、24、36、48、60、72h 后取出細胞，每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，按照 CCK-8 試劑盒說明進行操作，在酶標儀上450nm處檢測各孔細胞吸光度(A)值，繪制細胞的生長曲線圖。

6.酶聯免疫吸附測定：將MIN6細胞以 5×104個/孔接種于24孔板內并進行轉染。轉染后培養48h棄去原有培養基，每孔加500μl無糖KRBH溶液，于37℃、5% CO2細胞培養箱內孵育1h。棄無糖 KRBH 溶液，換用含5mmol/L 葡萄糖的KRBH 溶液孵育1h后，4℃離心20min收集上清液，或換用20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液孵育1h離心收集上清液。將所收集的上清液放置于-80℃，按照胰島素ELISA試劑盒檢測胰島素的濃度，采用酶標儀測定各孔在450nm波長處的吸光值。

7.動物造模：將60只C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(10只)、造模組(50只)，并分別給予基礎飼料和高脂高糖飼料喂養。喂養8周后，隔夜禁食12h，造模組小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素 30mg/kg，正常對照組小鼠空腹腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，每天1次，連續3次。在末次注射3天后剪尾取血，采用全自動生化分析儀測定小鼠空腹血糖值(FBG)，若FBG>11.1mmol/L且連續出現飲水量和尿量增多等現象則視為建模成功。選取造模成功的小鼠40只隨機分為NC組和miR-31-5p inhibitor組，每組 20只，NC組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC(50mg/kg)，miR-31-5p inhibitor組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor(50mg/kg)，每3天注射1次。正常組小鼠同時注射等量0.9%NaCl溶液，21天后測定各組小鼠FBG，并通過HE染色和免疫組化染色觀察胰腺組織的變化。

8.HE染色：以斷頭法處死各組小鼠，腹部解剖采集胰腺組織進行HE染色。PBS沖洗材料，在4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，常規石蠟包埋，切成厚度為3μm的薄片。蘇木精染色5min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3min，脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察并拍照。于光學顯微鏡下觀察小鼠胰腺組織病理學形態。

9.免疫組織化學染色：將石蠟切片脫蠟至水，采用0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，然后分別加一抗兔抗胰島素(1∶3000)與兔抗cleaved caspase-3(1∶200)，4℃孵育過夜。次日使用 PBS 沖洗2次，每次3min，再加二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育15min，PBS 沖洗2次，DAB 顯色。經過復染、脫水、透明、封片，在電子顯微鏡下觀察，進行圖像采集與分析。

結 果

1.miR-31-5p對MIN6細胞增殖的影響：RT-PCR檢測轉染后各組MIN6細胞中miR-31-5p表達情況。與miR-31-5p mimic NC組比較，miR-31-5p mimic組miR-31-5p的表達量顯著增加(P<0.05)，而miR-31-5p inhibitor組的表達量較miR-31-5p inhibitor NC組顯著降低(P<0.05，圖1)。CCK-8檢測結果表明，與miR-31-5p mimic NC組比較，miR-31-5p mimic組MIN6細胞在轉染36h時細胞增殖能力顯著下降，在本研究的時間范圍內，這種趨勢保持到轉染后96h(P<0.05)。與miR-31-5p inhibitor NC組比較， 在轉染后24h時miR-31-5p inhibitor 組MIN6細胞增殖能力顯著提高，36、72和96h時也均高于miR-31-5p inhibitor NC組(P<0.05，圖2)。

2.miR-31-5p對MIN6細胞胰島素分泌的影響：分別用5mmol/L葡萄糖的KRBH溶液或20mmol/L葡萄糖的KRBH溶液刺激轉染的各組MIN6細胞1h后，ELISA檢測分泌胰島素含量的實驗結果顯示，20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激使胰島素分泌增加，而與miR-31-5p inhibitor NC組比較， 20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液刺激下，miR-31-5p mimic組MIN6細胞胰島素的分泌受到抑制(P<0.01)，而miR-31-5p inhibitor 組胰島素的分泌量較miR-31-5p mimic NC組增加(P<0.01)。而在基礎糖濃度即5mmol/L 葡萄糖刺激下轉染 miR-31-5p mimic 或 miR-31-5p inhibitor的MIN6細胞胰島素的分泌水平沒有受到影響(表1)。

圖1 RT-PCR檢測各組MIN6細胞miR-31-5p表達水平與miR-31-5p mimic NC組比較，*P<0.05；與miR-31-5p inhibitor NC組比較，#P<0.05

圖2 CCK-8檢測各組MIN6細胞增殖情況與miR-31-5p mimic NC組比較，*P<0.05；與miR-31-5p inhibitor NC組比較，#P<0.05

表1 ELISA檢測各組MIN6細胞分泌胰島素量

與miR-31-5p mimic NC組比較,*P<0.01;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01

3.miR-31-5p對2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響：小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素實驗結束3天后檢測FBG，與正常對照組比較，模型組小鼠的FBG明顯升高(P<0.01)，達到15.87±3.34mmol/L，說明造模成功。進行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor，21天后檢測FBG結果顯示，與miR-31-5p inhibitor NC組比較，miR-31-5p inhibitor 組FBG顯著下降(P<0.01，表2)。HE 染色結果詳見圖3，對照組(Blank)小鼠胰腺組織中胰島呈圓形或橢圓形，胰島內細胞排列規則，細胞界限清晰且胞質飽滿，染色均勻；miR-31-5p inhibitor NC組胰島發生萎縮，形態不規則，胰島細胞細胞核固縮，胞質空泡增多，染色不均勻且部分細胞內出現脂質沉積；miR-31-5p inhibitor組胰島病理現象較miR-31-5p inhibitor NC組明顯改善，胰島形態改變較小，胰島細胞細胞核固縮程度減小，胞質空泡較少，染色較為均勻。免疫組織化學染色檢測了各組小鼠胰腺組織，片鏡下陽性反應物呈棕黃色。對照組(Blank)小鼠胰腺中幾乎無裂解caspase-3的表達，miR-31-5p inhibitor NC組胰腺中裂解caspase-3表達明顯，而miR-31-5p inhibitor組裂解caspase-3的表達較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。與HE染色結果一致，胰島素免疫組織化學分析表明對照組(Blank)小鼠胰島為圓形，胰島細胞(免疫反應陽性細胞)主要分布于胰島中心部位，胞質中充滿胰島素染色顆粒，均勻地散布于整個胰島且胞核不著色。miR-31-5p inhibitor NC組胰島形態被破壞，染色片中胰島素染色顆粒較少，細胞皺縮且排列分布不規則，有的胞質中胰島素染色顆粒明顯減少呈空虛狀態。而miR-31-5p inhibitor組較miR-31-5p inhibitor NC組這些現象均有不同程度的改觀(圖4)。

表2 抑制miR-31-5p表達對2 型糖尿病小鼠FBG的影響

與正常對照組比較,*P<0.01；與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01

圖3 各組小鼠胰腺組織病理學形態(HE,×200)A.Blank;B.miR-31-5p inhibitor NC;C.miR-31-5p inhibitor

圖4 各組小鼠胰腺組織裂解caspase-3和胰島素的陽性表達(IHC,×100)

討 論

1型糖尿病的特征是胰島β細胞逐漸凋亡從而導致胰島素的缺乏[14]。另外，胰島β細胞功能障礙在2型糖尿病的進展過程中起著關鍵作用，研究表明2型糖尿病的患者體內胰島β細胞數目減少[15]。因此，促進胰島β細胞的增殖與再生不僅是1型糖尿病的治療策略，也成為了2型糖尿病研究與治療的手段。

miRNA不僅在胰島β細胞增殖、凋亡、胰島素合成與釋放等過程中發揮作用，而且可以通過調控胰島素轉錄因子的表達進而維持機體糖平衡，例如miR 7、miR 26、miR 236、miR 357等已被證實參與胰腺發育、胰島素合成與分泌等過程[16,17]。此外，也有報道指出，胰島β細胞團與miRNA之間存在聯系，miRNA在胰島β細胞中具有細胞自主功能。例如，在懷孕或肥胖大鼠的胰島β細胞中miR-338-3p表達降低，特異性敲除胰島β細胞的miR-200可增加肥胖糖尿病小鼠β細胞的凋亡[18,19]。本研究通過將miR-31-5p mimic 與miR-31-5p inhibitor轉染到分化期的MIN6細胞中，以鑒定miR-31-5p是否影響MIN6細胞的增殖。研究結果表明，過表達miR-31-5p抑制MIN6細胞增殖而抑制miR-31-5p則促進MIN6細胞增殖。由胰島β細胞分泌和釋放的胰島素能夠將體內血糖維持在一個正常的水平，當胰島β 細胞功能受損，胰島素分泌不足時會引發糖尿病[20,21]。因此，筆者探究了在20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激下MIN6細胞的胰島素分泌水平，通過檢測發現轉染miR-31-5p mimic的MIN6細胞胰島素的分泌受到抑制，而轉染miR-31-5p inhibitor細胞的胰島素分泌量增加。由此說明，抑制MIN6細胞中miR-31-5p的表達有助于胰島β 細胞活性增加與胰島素分泌增加，從而起到降低血糖的作用。

2型糖尿病與肥胖密切相關。脂肪組織在葡萄糖代謝中起重要作用，能夠產生大量激素和細胞因子[22]。本研究通過高脂高糖飼料喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg構建2 型糖尿病小鼠模型，檢測到模型組小鼠的FBG達到15.87±3.34mmol/L，由此說明造模成功。接著對2型糖尿病小鼠進行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor，21天后檢測發現miR-31-5p inhibitor 組FBG較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。同時，通過胰腺組織形態觀察發現注射miR-31-5p inhibitor NC的小鼠胰腺組織發生病理損傷，裂解的caspase-3明顯表達，注射miR-31-5p inhibitor的胰腺組織病理損傷明顯改善，裂解的caspase-3幾乎沒有表達，提示抑制miR-31-5p可有效改善 2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗并改善胰腺病理損傷。

綜上所述，本研究證明了抑制miR-31-5p 表達可以促進MIN6細胞的增殖，從而保護胰島的功能，有效改善糖尿病小鼠的空腹血糖。miR-31-5p可能成為治療2型糖尿病的重要的標靶，為有效治療2型糖尿病提供了新的方法。后續研究將會深入探討miR-31-5p的作用靶點以及具體機制，為糖尿病的預防及治療提供可行的新思路。