不同消毒劑對HBV核酸和表面抗原的作用效果研究

邱 豐 周為民 尹文嬌 周文亭 曹經瑗 畢勝利 武桂珍

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)隸屬于嗜肝DNA病毒科，是一種直徑42nm的雙鏈DNA病毒[1～3]。形態學上，HBV由一個27nm的核衣殼和外層包裹的脂蛋白膜共同組成，病毒核酸(HBV DNA)位于核衣殼內，而HBV表面抗原(HBsAg)則鑲嵌在外層的脂蛋白膜中[4，5]。自然狀態下，過量的HBsAg常以直徑為22nm球形或管形顆粒在血液中循環[6，7]。

HBV對外界環境抵抗力較強，國內外常將HBsAg和HBV DNA作為反映病毒是否滅活的指標[8～10]。很多文獻證實，30～32℃環境下HBV可存活至少6個月，-20℃時可存活15年。在某些極端條件下，例如121℃高壓20min、100℃干烤1h或者100℃直接煮沸10min可確保滅活HBV[11～13]。然而，對于實驗室濺灑、滴漏造成的HBV污染，高壓干烤等方式顯然并不適用。因此，探索各種不同的化學消毒劑對HBV的作用效果就顯得尤為必要，之前有研究資料表明，含氯制劑、環氧乙烷、戊二醛、過氧乙酸和碘伏對HBV的滅活效果比較好[14～17]。本研究進一步評價了衛可(Virkon)、增效H2O2等新型消毒劑對HBV的作用效果。

材料與方法

1.實驗材料：選擇含氯消毒劑(有效氯濃度135～165mg/L)、1%衛可、75%乙醇+增效劑、1.0%過氧化氫+增效劑、1.5%過氧化氫+增效劑5種，其中，含氯消毒劑購自南京凈朗源環保科技有限公司，產品批號20171214；維可購自美國杜邦公司；其余3種均購自北京華夏昱凱科技發展有限公司，產品批號分別為201901、201902、201902。HBV病毒原液來自于筆者實驗室監測的急性乙型肝炎患者血清，保存于-20℃。原始血清中HBsAg含量為3000IU/ml，HBV DNA含量為5×106IU/ml。

表1 實時熒光定量PCR的引物和探針

結 果

1.病毒濃度(血清稀釋度)對消毒劑作用效果的影響：由于實驗室通常會面臨不同濃度的HBV陽性血清的濺灑情況，這些血清的病毒載量以及HBsAg濃度往往有成百上千倍的差別，為了模擬不同病毒載量和HBsAg的血清對消毒效果的影響，將實驗室保存的原始HBV陽性血清作了系列梯度稀釋，經消毒劑作用1h后,對HBsAg和HBV DNA兩個指標進行檢測，發現不同消毒劑的作用效果存在差別。1.0%的過氧化氫和1.5%的過氧化氫對高、中、低濃度的HBV陽性血清均無效，所有稀釋度的血清經作用1h后HBsAg和HBV DNA仍然為陽性，含氯消毒劑和75%乙醇對低濃度的HBV陽性血清有一定的效果，但對高濃度血清無效，在本研究所涉及的5種消毒劑中，只有1%衛可對HBV核酸的破壞效果較為明顯(表2)。

表2 病毒濃度(血清稀釋度)對消毒劑作用效果的影響

2.不同劑量消毒劑對高濃度原始病毒的作用效果：為探索每種消毒劑最佳的使用劑量，分別使用了2倍、4倍、10倍、20倍和40倍的消毒劑與原倍HBV陽性血清作用1h，加入硫代硫酸鈉中和后測定了HBsAg和HBV DNA的含量。20倍體積的1%衛可與原倍血清作用后可使HBsAg和HBV DNA兩項指標均發生陰轉，而其他兩種消毒劑都達不到類似效果，增大至40倍體積后仍有指標為陽性，詳見表3。

表3 不同劑量消毒劑對原倍HBV陽性血清的作用效果

3.作用時間對消毒劑效果的影響：由于1%衛可消毒劑具有使用劑量較小、作用效果顯著等特點，在實驗室發生HBV陽性血清濺灑等生物安全事故時，其實用性要強于含氯消毒劑和75%乙醇。而表3的實驗數據已經顯示20倍和40倍體積1%衛可均能夠徹底破壞HBsAg和HBV DNA。在此基礎上進一步探索了20倍以及40倍體積1%衛可的最佳處理時間，不論是20倍體積還是40倍體積，1%衛可只有在作用1h之后才能使HBsAg和HBV DNA均發生陰轉(表4)。

表4 作用時間對1%衛可消毒劑作用效果的影響

討 論

長期以來缺乏有效的HBV體外培養模型一直是HBV滅活效果評價的最大阻礙，雖然最近HBV的特異性受體及其體外培養系統取得了突破性的進展，但是該系統中使用的HepG2-NTCP細胞株不易獲得，而且HBV體外培養比較耗時費力，因此本研究選擇了HBsAg和HBV DNA這兩項廣泛使用的指標用于評價不同消毒劑的作用效果，一方面是因為這兩個指標的檢測方法比較成熟，操作簡便，價格低廉，檢測結果穩定可靠，重復性強；另一方面，HBsAg和HBV DNA作為HBV的兩種重要組成成分，在一定程度上也能代表消毒劑對病毒本身的作用效果[8，20]。

目前實驗室常用的消毒劑種類繁多，性狀各異，之前已有研究證實含氯消毒劑和乙醇處理后并不能使血清中的HBsAg抗原性達到陰性水平，這與本研究的實驗結果相符[14，15]。但是，本研究進一步發現，在血清中HBsAg含量較低的情況下(低于30IU/ml)，含氯消毒劑和乙醇的作用效果還是相當明顯的，這兩種實驗室最常用的消毒劑對于低濃度的HBsAg具有較好的破壞作用。

除傳統消毒劑之外，本研究還驗證了衛可等新型消毒劑對HBsAg以及HBV DNA的作用效果。衛可外觀為粉紅色粉末，是一種過硫酸氫鉀復合鹽，屬于酸性氧化劑，易溶于水，在實際使用中常配制成1%的溶液，衛可的消毒機制在于通過產生低分子自由基使病原表面蛋白質變性凝固從而殺滅微生物[21，22]。本研究發現，無論是高濃度還是中低濃度的HBV陽性血清，使用20倍體積以上的1%衛可溶液處理1h之后均可使HBV DNA和HBsAg等指標轉陰，證實了衛可良好的作用效果。除此之外，衛可相較于其余種類的消毒劑還具備顯著的優點。首先，衛可配制方便，配好的溶液內含有特有的粉紅色活性指示劑，可以通過顏色的變化判斷消毒劑的有效性。其次，衛可揮發性不強，對人體皮膚、呼吸道黏膜和眼睛等部位的刺激較小，對金屬的腐蝕作用也比含氯消毒劑要弱，基本安全無害。最后，衛可價格低廉，生產成本比醫用乙醇等大多數的消毒劑要低。

綜上所述，本研究通過HBsAg和HBV DNA等指標間接地評估了各種消毒劑的作用效果，研究結果對于實驗室處理HBV陽性血清濺灑等生物安全事故具有一定的參考價值。采用最新的病毒體外培養體系，建立成熟可靠的評價方法來直接測定HBV的感染性是今后努力的方向。