血清miR-711、miR-203對阿爾茨海默病的診斷效能評估

于 明 錢勝男 徐宇浩 孟 潔

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人發生癡呆的首要病因，給家庭和社會帶來了嚴重的負擔[1]。輕度認知障礙(mild cognitive impairment，MCI)是未發展到癡呆的過渡階段[2]。其中，以記憶損害為主要表現的遺忘型輕度認知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment，aMCI)是結局易發展為AD源性癡呆或AD癡呆(AD-dementia，ADD)的高風險MCI類型，可認為是AD病程發展的早期階段[3]。因此對aMCI和AD患者進行早期識別和干預至關重要。然而，AD和aMCI作為以認知功能障礙為主要表現的疾病，其診斷過程中過度依賴量表評分，主觀性較強，現仍缺乏高效便捷的客觀指標應用于診斷。目前血清miRNA以簡單、無創、迅速等優點廣泛應用于多種疾病的診斷和監測。已有諸多研究顯示miRNAs在神經系統發育和高級腦功能的生理中起著重要作用，并參與了神經變性疾病的病理機制[4～6]。miR-711和miR-203作為參與神經細胞凋亡的兩個關鍵分子，已有研究應用于腦損傷的診療，然而在AD患者中的應用尚未見報道[7,8]。本研究通過檢測aMCI及ADD患者血清中miR-711和miR-203的表達，評價兩者對aMCI、ADD診斷價值。

資料與方法

1.一般資料收集：采用病例對照研究，收集18例健康志愿者作為正常對照組(NC)，并選取2018年11月～2019年5月在江蘇大學附屬醫院神經內科就診的18例aMCI、18例ADD患者作為研究對象。所有研究對象均由專業的神經內科醫生進行臨床診斷及認知功能評估，并行血液學檢查排除肝臟、腎功能障礙、甲狀腺、血清梅毒和HIV抗體及腫瘤標志物陽性的受試者。所有受試者均簽署知情同意書。本研究經江蘇大學附屬醫院醫學倫理學委員會審查批準。

2.納入標準：aMCI組納入標準：①根據國際工作組在2003年提出的MCI診斷及分類標準[9]和Petersen提出的aMCI診斷標準[10]：可通過患者的病史資料、知情人講述或臨床醫生觀察發現的以記憶力減退為主訴的認知功能障礙，其他認知領域保持相對完整；記憶損害超出了患者年齡和教育背景的正常功能范圍，但不足以診斷為癡呆；日常生活能力不受影響；②臨床癡呆評定量表(CDR)評分0.5分；③頭顱CT/MR除外腦血管病、占位及其他異常信號。ADD組納入標準：①2011年美國神經病學、語言障礙和卒中研究所-AD及相關疾病協會(NINCDS-ADRDA) 提出的診斷標準中的“很可能的AD癡呆”[11]；②排除帕金森、路易體癡呆等其他原因所致的癡呆；③CDR評分≥1分；④頭顱CT/MR有雙側顳葉內側萎縮的證據，支持AD的診斷，且除外腦血管病、占位及其他異常信號。NC組納入標準：①年齡和性別與病例組完全匹配；②日常生活功能良好；③CDR評分0分，認知功能正常；④直系親屬中無癡呆患者；⑤頭顱CT/MR及神經系統檢查無異常。

3.排除標準：嚴重精神疾病、腫瘤、風濕免疫性疾病、血液系統疾病、嚴重的肝臟、腎功能不全、其他神經系統疾病、腦器質性疾病和顱腦外傷等。

4.血清樣本收集：所有研究對象均在清晨空腹狀態下使用促凝管采集4～5ml靜脈血，置于4℃冰箱保存2h后，于4℃離心機以3000r/min離心10min，收集上清液進行miR-711和miR-203表達水平測定。

5.引物設計及合成：采用莖環法進行引物合成，所有引物均由上海生物工程技術有限公司設計合成。熒光定量PCR引物序列如下：miR-711：上游引物5′-CGGGGACCCAGGAGA-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。miR-203b-5p：上游引物5′-GCGCGTAGTGGTCCTAAACAT-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

6.RNA提取及定量檢測：首先參照miRNA提取試劑盒的指示，提取血清中總miRNA，并使用分光光度儀檢測RNA濃度和純度；然后用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)對RNA進行反轉錄反應；繼之進行熒光定量PCR反應：按照UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒說明配置50μl的反應體系，以U6作為內參基因，按照三步法反應程序進行PCR反應，預變性(95℃ 10min)、變性(95℃ 10s)、退火(58℃ 30s)、延伸(72℃ 32s)，共35個循環；最后用溶解曲線(95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、 60℃ 15s)檢測特異性。按照2-ΔΔCt算法計算相對定量表達分析。

7.神經心理學測試：由神經科醫生采用MoCA和CDR量表對所有受試者在安靜環境中進行認知功能評估。

結 果

1.3組受試者臨床資料比較：3組在年齡、性別、受教育年限方面比較，差異無統計學意義(P>0.05，表1)，具有可比性；3組危險因素比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組CDR和MoCA評分兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)。與NC組比較，aMCI組和AD組的MoCA評分均降低，而CDR評分均升高。

表1 3組受檢者的一般資料

2.3組血清miR-711和miR-203相對表達量的比較：3組間miR-711和miR-203相對表達量差異有統計學意義(F=12.28，P=0.000；F=12.20，P=0.000)。事后分析發現,與NC組比較，aMCI和ADD組血清miR-711表達均增加(P<0.01、P=0.000)，且在ADD組中表達增加更明顯；aMCI和ADD組血清miR-711表達比較差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。與NC組比較，ADD組血清miR-203表達增加(P=0.000)、aMCI組血清miR-203表達差異無統計學意義(P>0.05)；ADD組血清miR-203表達較aMCI組增加更加明顯(P<0.01，圖2)。

圖1 血清中miR-711在3組中的相對表達水平*P<0.01，**P=0.000

圖2 血清中miR-203在3組中的相對表達水平*P<0.01,**P=0.000

3.血清miR-711和miR-203相對表達量與認知功能的關系：Spearman相關性分析表明，血清miR-711和miR-203相對表達量與MoCA評分呈負相關(r=-0.52，P=0.000；r=-0.49，P=0.000，圖3)。

圖3 miR-711、miR-203與MoCA評分的相關性

4.血清miR-711和miR-203對aMCI診斷價值的ROC分析：應用ROC曲線評價血清 miR-711用于診斷aMCI時，曲線下面積(AUC)為0.812(95%CI：0.669～0.954，P<0.01，圖4)，具有一定的診斷價值；其診斷臨界值為 1.626 時，特異性為72.2%，敏感度為88.9%。血清 miR-203用于鑒別aMCI及ADD時，AUC為0.718(95%CI：0.551～0.884，P<0.05，圖5)，具有一定的鑒別診斷價值；其診斷臨界值為1.965時，特異性為72.2%，敏感度為61.1%。

圖4 miR-711對診斷遺忘型輕度認知障礙的ROC曲線

圖5 miR-203對鑒別遺忘型輕度認知障礙和ADD的ROC曲線

5.血清miR-711和miR-203對ADD診斷價值的ROC分析：單獨檢測血清中miR-711和miR-203表達水平對ADD患者的診斷有很高的價值，且兩者聯合診斷價值更高(P=0.000，圖6)。檢測血清 miR-711水平用于診斷ADD時，AUC為0.875(95%CI：0.763～0.987，P<0.01)，具有一定診斷價值；其診斷臨界值為 0.536 時，特異性為 88.9%，敏感度為77.8%。檢測血清miR-203水平用于診斷 ADD時，AUC為0.889(95%CI：0.776～1.000，P<0.01)，診斷價值較高；其診斷臨界值為0.715時，特異性為100%，敏感度為66.7%。運用Logistic回歸模型構建血清miR-711和miR-203聯合診斷的ROC曲線分析顯示，AUC為 0.948(95%CI：0.871～1.000，P=0.000)；當診斷臨界值為0.46時，特異性為94.4%，敏感度為94.4%。

圖6 血清miR-711、miR-203對ADD單獨及聯合診斷的ROC曲線

討 論

AD是隱匿起病、進行性發展的神經退行性疾病，因高發生率和巨大的社會經濟負擔成為亟待解決的問題。近10余年來對AD的發展過程已有了深入了解，目前國際公認的AD的3個階段包括無癥狀持續發展的臨床前階段、AD源性的MCI階段以及終末的AD癡呆階段。aMCI作為廣義的MCI中常見的類型，較其他MCI更易向ADD轉化，認為是ADD的臨床高危階段[12]。目前認知障礙性疾病的診斷和鑒別以臨床癥狀、神經心理學量表、神經影像學為主，NIA-AA也提出了腦脊液Aβ42和tau蛋白等生物學標志物，但都有一定的局限性[10]。作為可早期識別和診斷認知障礙性疾病的非侵入性、廉價、高效的生物學標志物，血清miRNA成為目前癡呆領域研究的熱點[13]。

研究發現，miR-34a-5p和 miR-545-3p在AD患者血清中表達水平明顯高于MCI和NC組，可作為早期診斷AD的標志物[14]。Hill等[15]研究發現AD患者外周血中miR-29、miR-107、miR-181及miR-146存在著差異性表達，可能參與了AD的發病機制，但目前尚無達成一致的高特異性的血清診斷標志物。相關研究發現認知障礙疾病的發病機制與多種因素相關，包括神經細胞凋亡、氧化應激、線粒體及突觸損傷等，miR-711和miR-203曾證明可作為創傷性腦損傷的潛在生物學標志物，但在認知障礙疾病中尚無研究，檢測兩者在血清中的表達水平可能為aMCI和ADD的診斷提供一定的應用價值[16]。

本研究發現，aMCI和ADD組中血清miR-711表達均較NC組增加，以ADD組增加更明顯；但aMCI和ADD組的血清miR-711表達差異無統計學意義。相關性分析表明，miR-711表達水平與MoCA評分呈負相關，可見miR-711可作為評估認知功能障礙程度的指標。另外，ROC曲線分析顯示，miR-711對ADD及aMCI的診斷具有一定的應用價值。在AD的臨床前階段，雖然患者未出現明顯的認知功能改變或僅有輕微受損，但是體內的病理學改變已經出現[17]。隨著認知功能受損的加重，病理標志物的變化可能更加顯著，更易被檢出。本研究表明，雖然aMCI患者認知功能減退不明顯，但miR-711在體內的表達量已發生改變，故可將miR-711作為aMCI初篩標志物。已有研究發現，在控制性腦皮質撞擊模型中，小鼠腦損傷后3h就可檢測到海馬中miR-711表達水平上調；而海馬與認知功能密切相關，推測本研究中血清miR-711的早期改變可能與海馬早期受損機制相關。另外，通過KEGG等通路分析以及靶向因子等實驗證實，miR-711可靶向抑制AKT誘導神經細胞凋亡，同時也參與氧化應激通路，這可能與認知障礙性疾病的機制相關[7]。

本研究還發現，ADD組血清miR-203表達較NC組及aMCI組均增高，但aMCI組血清miR-203表達與NC組比較差異無統計學意義。因此，miR-203雖然不能發現早期的認知功能障礙，但監測血清miR-203的表達水平可能能夠反映認知障礙的損害程度。實驗證明，在原代培養的小鼠皮質神經元中，過表達miR-203導致細胞凋亡增加，同時神經變性相關突觸表達也下調[18]。因此，miR-203可能通過參與突觸的丟失機制導致認知功能減退。另外，ROC曲線分析表明miR-203對AD有一定的診斷價值，且miR-711和miR-203二者聯合檢測時AUC最大，AD的診斷效能也得到了進一步提升。

綜上所述，本研究檢測了miR-711和miR-203在認知障礙性疾病患者血清中的表達，提示兩者有望成為疾病診斷的血清學標志物，具有一定的推廣及應用潛力。但是，本研究中血清樣本量少，也未對aMCI患者進行隨訪觀察其轉歸情況，因此后期需要擴大樣本量進行多中心的臨床實驗及完善隨訪研究。此外，本實驗組后期還將通過構造細胞及動物模型進一步探索miR-711和miR-203參與認知障礙性疾病發生、發展的分子機制，旨在對疾病的篩查、預防及治療提供新靶點。