脂聯素對膿毒癥小鼠腦損傷的保護作用及機制

張占琴 王 強

膿毒癥是一種由機體對感染的反應失調引發危及生命的多器官功能障礙的致死性疾病[1]。據流行病學報道，膿毒癥患者約占總住院患者的2%，在重癥監護病房(intensive care unit，ICU)中其所占比例為30.2%，病死率高達55.7%[2]。膿毒癥患者常常出現神經系統并發癥，其與患者疾病的嚴重性和預后密切相關[3]。膿毒癥腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥最常見的中樞神經系統并發癥，目前SAE的發生率尚無定論，國外有研究報道其發生率可高達70%[4]。SAE可發生在膿毒癥的任何階段，主要臨床常表現為精神活動的延遲，注意力、定向力受損等，臨床統計顯示腦功能損傷和患者預后呈正相關， 轉入ICU時存在昏迷的膿毒癥患者病死率高達60%，SAE是預測患者病死率的獨立風險因素，合并SAE顯著增加膿毒癥的治療難度[5]。此外，Iwashyna等[6]對膿毒癥存活患者進行長達3年的隨訪，發現依然有17%患者發生中、重度認知功能障礙。因此積極治療SAE對降低膿毒癥患者病死率及改善預后具有重要意義。

有研究表明，脂聯素缺乏增加促炎性細胞因子表達，血清中低脂聯素濃度與膿毒癥的嚴重程度具有負相關性，然而脂聯素是否具有改善膿毒癥腦損傷的作用尚未可知[7]。脂聯素可引起肌細胞線粒體數量增加，膿毒癥患者普遍存在線粒體抗氧化能力下降和活性氧、自由基過度產生，最終導致線粒體氧化還原平衡失衡，而脂聯素對膿毒癥腦損傷的保護作用是否與改善線粒體功能有關，這一問題仍有待研究[8，9]。本研究應用脂聯素對膿毒癥模型小鼠進行干預，探討脂聯素治療對膿毒癥腦損傷發揮的效應，以期為脂聯素應用于SAE患者提供實驗理論依據。

材料與方法

1.實驗動物：6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量22～25g，購自西安交通大學動物實驗中心，購買后適應性喂養3天，予自由飲食飲水。所有動物實驗遵循國家所制定的有關實驗動物保護和使用的指南，并經西安交通大學實驗動物倫理學委員會批準通過。

2.主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Escherichia Coli O55：B5，美國Sigma 公司)；脂聯素(以色列ProSpec公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide diamutase，SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白(B-cell lymphoma 2-Associated X，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)和β-actin一抗(武漢三鷹生物技術有限公司)。

3.分組、模型制備和標本采集：168只SPF級雄性C57BL/6小鼠，采用數字表法隨機分為空白對照組(CON組)、脂聯素對照組(APN組)、膿毒癥模型組(LPS組)、脂聯素干預組(LPS + APN組)。參照文獻[10]方法采用腹腔注射LPS 15mg/kg制備膿毒癥腦病模型，CON組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS組側腦室注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS+APN組造模后30min給予側腦室注射APN 0.1μg/g。一部分小鼠(每組10只)造模24h后于麻醉下斷頭取大腦，迅速分離大腦組織，取左側大腦海馬切面置于40g/L多聚甲醛溶液中固定，右側海馬組織液氮速凍后轉于-80℃ 冰箱保存待用。其余小鼠(每組16只)造模后2周采用曠場實驗和跳臺實驗對小鼠進行行為學實驗，實驗完畢后處死小鼠。本研究中動物處置方法符合動物倫理學標準。

4.曠場實驗：取一個長50cm×50cm×50cm的曠場，箱底劃分為25個方格，造模后2周將小鼠(n=16)放入曠場中心方格內，在曠場上方安置攝像機，記錄5min內小鼠跨格數和站立次數。每次實驗后清理小鼠留在曠場中的糞便。共進行為期2天的測試，第1天為訓練期，第2天為試驗期。由于動物對于再次進入同一個熟悉場景具有適應性的特性，該測試對跨格數和站立次數的統計分析主要用來評估訓練期的運動表現和試驗期的非空間學習記憶能力。

5.跳臺實驗：造模后2周進行為期2天的跳臺實驗(n=16)，訓練期將小鼠放入跳臺反射箱，適應3min后將其移上安全臺，然后底部電柵欄通電，小鼠被電擊2s后取出，并記錄其從平臺跳下來的時間，訓練期內如果該動物未跳下平臺則棄之不用。試驗期(24h后)將動物再次放在平臺上，觀察3min，記錄小鼠從平臺跳下所需的時間，即跳臺潛伏期。如果動物跳下平臺時受到電擊，再次放置于平臺后動物可形成記憶而不跳下平臺，跳臺潛伏期常被用來作為評價學習記憶能力的重要指標。

6.蘇木精-伊紅(hemotoxylin and eosin，HE)染色觀察皮質病理改變： 造模24h后分離大腦組織(n=5)，取左側大腦海馬切面經40g/L多聚甲醛固定后，常規脫水、透明、石蠟包埋，海馬組織切片后行HE染色，正置顯微鏡下采集數據并拍照。

7.海馬線粒體ROS、MDA、SOD檢測：造模24h后取右側海馬組織(n=5)，按先前方法提取線粒體，裂解液重懸后BCA法測定蛋白水平后備用[11]。將線粒體懸液稀釋至蛋白質量濃度為1mg/ml，取50μl線粒體懸液加入反應液，酶標儀行定量檢測，按相應的說明書步驟操作，酶標儀讀取吸光度值，按公式計算出數值后分別除以相應蛋白濃度即得各樣本ROS、MDA、SOD水平。

8.海馬Bcl-2、Bax、cyt-c、cleaved caspase-3蛋白表達的檢測: 造模24h后取右側海馬組織(n=5)，提取海馬總蛋白制備上樣樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白電轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。相繼孵育相應的一抗和二抗之后，經Bio-Rad凝膠成像系統掃描獲得圖像。

結 果

1.各組小鼠行為學特征：造模后2周采用曠場實驗(n=16)和跳臺實驗(n=16)對4組小鼠進行行為學實驗。在曠場實驗中，跨格數和站立次數的統計用來反應動物開發新環境的運動能力。訓練期各組小鼠間的跨格數和站立次數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與訓練期比較，試驗期CON組和APN組跨格數和站立次數顯著減少(P<0.01)，表明小鼠具有良好的記憶能力。與訓練期比較，LPS組小鼠跨格數和站立次數并未有明顯改變，脂聯素干預(LPS+APN組)后，小鼠跨格數和站立次數減少(P<0.01)。在跳臺實驗中，訓練期各組小鼠從跳臺跳下來的時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與訓練期比較，試驗期CON組和APN組跳臺潛伏期顯著延長(P<0.01)，同樣表明小鼠具有良好的記憶能力。在試驗期，與CON組比較，LPS組跳臺潛伏期延遲顯著降低，提示記憶受損(P<0.01)；與LPS組比較，脂聯素干預(LPS+APN)組可顯著延長潛伏期(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 4組小鼠曠場實驗和跳臺實驗行為學特征(n=16)A.曠場實驗；B.跳臺實驗；與訓練期比較，#P<0.01

2.各組小鼠海馬形態學改變：選取海馬CA1區進行形態學觀察,CON組和APN組小鼠神經細胞形態結構清晰，細胞排列規則致密，神經元胞質豐富，胞核大而圓，核仁清楚(圖2中A、B)；LPS組可見細胞結構不清，神經元數量減少，神經元空泡樣改變，核固縮、深染(圖2C)；與LPS組比較，LPS+APN組多數細胞結構清晰，神經元數量明顯增多，發生空泡樣變、核固縮以及深染的神經元減少(圖2D)。

圖2 4組小鼠海馬形態學改變(n=5，HE染色，×400)A.CON組；B.APN組；C.LPS組；D.LPS+APN組

3.各組小鼠海馬氧化損傷情況：與CON組比較，LPS組小鼠海馬線粒體ROS和MDA水平升高，SOD活力下降，差異均有統計學意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.01；SOD：P=0.000)；與LPS組比較，LPS+APN組線粒體ROS和MDA水平下降，SOD活力增強，差異均有統計學意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.05；SOD：P=0.000)，詳見表1。

表1 4組小鼠海馬線粒體ROS、MDA和SOD表達情況

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.05,##P=0.000

4.各組小鼠海馬凋亡相關蛋白的表達情況：造模24h后取右側海馬組織檢測凋亡相關蛋白表達，與CON組比較，LPS組小鼠海馬Bcl-2表達下降(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達升高(Bax：P=0.000；cleaved caspase-3：P<0.01)；與LPS組比較，LPS+APN組小鼠海馬Bcl-2表達升高(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達下降(Bax：P<0.01；cleaved caspase-3：P<0.01)，詳見圖3和表2。

討 論

脂聯素是良好的胰島素增敏劑，抗炎調節劑和抗動脈粥樣硬化分子，脂聯素缺乏增加促炎性細胞因子表達，放大肥胖和膿毒癥中促炎表型，補充脂聯素后通過調控氧化/硝化應激反應減輕LPS所致膿毒癥炎癥性肺損傷和心肌損傷程度等，其可能成為改善膿毒癥相關臟器功能損傷以及預后的潛在治療靶點或藥物[12,13]。SAE發生率高，治療難度大，然而其病理生理機制尚不十分明確且未有突破性進展[5，14，15]。目前已經公認腹腔注射LPS能夠普遍引起腦損傷，本研究采用腹腔注射LPS制備膿毒癥模型，探索脂聯素對膿毒癥腦損傷的作用及機制。結果顯示LPS組和LPS+APN組小鼠HE染色見空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變，提示LPS可引起膿毒癥小鼠腦組織損傷。與LPS組比較，LPS+APN組空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變有所減輕，且使用脂聯素干預后LPS+APN組小鼠在曠場和跳臺實驗中表現出的學習記憶能力有所改善，表明脂聯素對膿毒癥小鼠腦組織損傷具有一定的保護作用。

圖3 4組小鼠海馬內Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達

表2 各組細胞中Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.01,##P=0.000

已有研究表明ROS生成增多、氧化應激和細胞凋亡等與SAE的發生、發展密切相關[9,16]。線粒體作為細胞的能量工廠，不僅參與細胞能量供應、鈣穩態調節、氧化應激、凋亡等生理過程，更為重要的是，匯聚于線粒體的各種細胞信號通路以及線粒體釋放的各種關鍵因子，是決定細胞存活的最終通路[17]。脂聯素通過脂聯素受體1誘導細胞外Ca2+內流、激活Ca2+/CaMKKβ、AMPK和SIRT1和減少PGC-1α乙酰化，最終引起肌細胞線粒體數量增加，這些研究結果提示脂聯素在改善線粒體功能方面具有重要作用[8]。本研究結果顯示，膿毒癥小鼠海馬線粒體中ROS和脂質過氧化產物MDA生成增多，而抗氧化酶SOD活力下降，提示膿毒癥腦組織損傷發生時線粒體氧化應激明顯增強。APN干預后，海馬線粒體中ROS和MDA水平降低，而SOD活力增強，說明脂聯素可減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應激，從而發揮抗氧化保護作用。

線粒體是過量ROS產生后的主要促凋亡靶點，ROS大量產生引起線粒體膜脂質過氧化、線粒體膜上蛋白質和線粒體DNA氧化損傷，隨后線粒體膜通透性增加和線粒體通透性轉換孔開放使Ca2+、Cyt-c、凋亡誘導因子AIF等大量釋放，激活pro-caspase-9進而觸發caspases級聯效應引起細胞凋亡[18]。過量的活性氧也可使線粒體電子傳遞鏈解偶聯，下調ATP產生水平，上調促凋亡蛋白Bax的表達水平，最后使線粒體外膜破裂，導致細胞凋亡[19，20]。在本研究中，膿毒癥小鼠海馬凋亡細胞明顯增多，且Bcl-2表達減少，而Bax和cleaved caspase-3表達增加，提示膿毒癥腦損傷發生與線粒體凋亡通路激活有關，這與先前的其他研究結果一致[21,22]。雖然目前有相當多的證據表明脂聯素及其受體在大腦中廣泛表達，只有少數研究關注了脂聯素在腦功能紊亂中的作用以及修飾脂聯素信號通路的藥物的治療潛力，它們在腦疾病中的確切作用仍不十分清楚。本研究發現脂聯素干預后，Bcl-2表達上調，而Bax和cleaved caspase-3表達減少，提示脂聯素可通過抑制線粒體促凋亡通路激活在膿毒癥腦損傷中發揮抗凋亡作用。

綜上所述，本研究顯示線粒體功能障礙和線粒體促凋亡通路激活可能參與了膿毒癥腦損傷的發病過程，而脂聯素則通過減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應激抑制線粒體促凋亡通路激活，從而在膿毒癥腦損傷中發揮保護作用，為臨床運用脂聯素治療SAE提供了實驗依據。本研究只針對脂聯素進行了探討，而海馬脂聯素受體及其參與脂聯素作用的具體分子機制仍不明確，有待于進一步研究。