一種細胞內快速標記鄰近蛋白復合物的新方法

劉 健 周 姍 戴大鵬 蔡劍平

生物體功能的實現需要蛋白質的參與，其中多數生物學功能的行使必須借助于多種蛋白質間相互配合，組成蛋白質復合物來實現。研究蛋白質間的相互作用及定位組成可以更好地理解相關蛋白質的功能和細胞內外復雜的信號轉導網絡。近年來，鄰近蛋白質標記方法(protein-proximity labeling)被越來越廣泛地應用于解析細胞內蛋白復合物的組成[1, 2]。該方法通過應用一種可以混雜標記的酶與目的蛋白融合表達，再添加特定底物，比如生物素，進而使得該酶可以在體內(in vivo)共價催化納米級別范圍內的相關內源性蛋白。已有的鄰近標記方法主要分為兩大類：一類是以生物素連接酶為基礎，如BioID、BioID2、BASU等[3]；另一類以過氧化物酶為基礎，如APEX 和APEX2。BioID和 APEX2是目前應用最為廣泛的鄰近蛋白質標記方法，二者各自有其獨特的優勢。BioID標記方法雖然簡單且無毒，只需加入生物素來起始標記過程，但其生物素標記反應時間較長，需要18～24h，無法捕捉瞬時或作用力較弱的蛋白復合物。與之相反，APEX2反應速度較BioID迅速，適用范圍廣，但其標記過程需要對樣品進行H2O2處理，導致有些樣品因其毒性作用而無法適用，同時氧化處理也可能會改變細胞內微環境，從而破壞某些蛋白與蛋白間的相互作用。

為彌補現有鄰近蛋白標記方法的不足，2018年Alice YTing領導的科研小組通過對BirA*進行酵母展示技術定向突變，獲得了一種生物素標記時間顯著降低的生物素連接酶——TurboID, 該酶在相同條件下僅需用生物素處理短短10min即可獲得與傳統BioID類似甚至更高的標記效率，徹底解決了限制BioID系統應用的最主要技術瓶頸[4]。本研究率先在國內重建了TurboID系統，并將其置于Tet-on系統的調控之下，以精確調控目的蛋白的表達量，隨后將所有表達單元插入改造后的慢病毒載體，借以大大拓展該系統的細胞適用范圍。

材料與方法

1.材料：HeLa細胞及293T細胞購自美國ATCC公司。慢病毒載體Lenti-Cas9-Blast、PSPAX2及PMD2.G購自美國Addgene公司。轉染試劑Lipofectamine 3000、殺稻瘟菌素、蛋白酶抑制劑(halt protease inhibitor cocktail, EDTA-free)購自美國Thermo Scientific公司。強力霉素、Hoechst 33258、生物素、碳酸氫銨、Triton X-100購自美國Sigma公司。Streptavidin-HRP 購自英國Abcam公司。兔抗人YB1單克隆抗體(D2B12)購自美國Cell Signaling Technology公司。兔抗人GAPDH單克隆抗體購自上海Abmart公司。限制性內切酶、DNA ligation kit Ver 2.1、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真酶購自日本TaKaRa公司。切膠純化及PCR產物純化試劑盒購自美國Omega公司。

2.基因及引物合成：北京博邁德公司合成載體構建用引物(表1)及含TurboID編碼區的插入片段。該插入片段由多克隆位點MCS(包含BsrGⅠ、BstBⅠ、AgeⅠ、BSu36Ⅰ、SfiⅠ、XhoⅠ、PacI酶切位點)、TurboID、HA標簽序列、Tet-on系統(含Tight啟動子、PGK啟動子、殺稻瘟菌素抗性基因BSD、P2A序列及rtTA)組成，5′及3′末端分別加入KpnⅠ及EcoRⅠ酶切位點(圖1)[4～6]。

表1 載體構建用引物列表

下劃線所示為括號內的酶切位點

圖1 Lenti-TurboID載體的構建路徑

3.Lenti-TurboID質粒載體構建：37℃下使用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切Lenti-Cas9-Blast質粒，2%瓊脂糖凝膠電泳后回收7.5kb的片段lenti-NR。KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切含TurboID編碼區的合成片段，并與酶切的lenti-NR連接，獲得慢病毒質粒載體命名為Lenti-TurboID (圖1)。送北京天一輝遠生物技術公司使用表1中列出的測序引物進行測序分析，以確保插入的合成基因序列完全正確。

4.TurboID-YB1及TurboID-GFP融合表達載體的構建：以人YB1 cDNA全長質粒克隆及pEGFP-C1載體(美國Clontech公司)為模板，使用表1中列出的擴增引物，利用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真酶分別擴增YB1及GFP的開放閱讀框編碼區，同時加入預設酶切位點。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外燈下切取YB1及GFP目的條帶并使用切膠純化試劑盒純化產物，回收產物分別使用BstBⅠ/Bsu36Ⅰ或AgeⅠ/Bsu36Ⅰ 37℃下酶切1.5～2.0h，產物純化后與經同樣雙酶切的Lenti-TurboID載體連接，獲得融合表達載體TurboID-YB1及TurboID-GFP。

5.慢病毒包裝及侵染：6孔板內種植4×105個293T細胞，次日參照Lipofectamine 3000說明書轉染TurboID-YB1、TurboID-GFP及輔助質粒PSPAX2及PMD2.G，培養48h后收集含病毒培養基并使用0.45μm濾膜過濾后用于后續侵染。取適量病毒加入到融合度為50%的HeLa細胞中，培養24h后重懸細胞于含2μg/ml殺稻瘟菌素的DMEM高糖培養基中篩選培養14天，期間每隔2天更換1次新鮮培養基。

6.強力霉素誘導濃度篩選：6孔板內種植3×105個第5步獲得的融合表達TruboID-YB1的HeLa細胞，次日更換新鮮培養基并加入強力霉素，使其終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0和1.5μg/ml。繼續培養24h后使用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞，取30μg細胞裂解物進行12% SDS-PAGE電泳。電泳產物利用濕轉儀轉至PVDF膜，使用5% 脫脂牛奶室溫封閉60min，隨后加入含兔抗人YB1 單克隆抗體(1∶1000的稀釋比例)或兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶5000的稀釋比例)的一抗反應液4℃振蕩孵育過夜。次日TBST洗5次后加入含有山羊抗兔IgG-HRP(1∶4000)的二抗反應液室溫振蕩孵育1h。TBST洗3次后使用Millipore Immobilon Western試劑盒進行曝光顯色，以檢測融合蛋白的表達量。

7.GFP表達量的檢測：24孔板內使用含10%小牛血清的DMEM培養基及添加0.5μg/ml強力霉素的培養基培養第5步獲得的融合表達TruboID-GFP的HeLa細胞，培養24h后PBS洗滌1次，替換為4%的多聚甲醛溶液固定細胞5min，加入含10mg/L Hoechst 33258 的PBS溶液，室溫染色10min, 倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

8.生物素標記時間篩選：使用含0.125μg/ml強力霉素的培養基培養細胞24h以誘導TruboID-GFP融合蛋白的表達，PBS洗滌細胞2次，使用含50μmol/L生物素的無血清DMEM培養基分別處理TurboID-GFP和TurboID-YB1兩種細胞0、15、30、60和120min。PBS洗滌細胞2次，使用新鮮配制的裂解液[50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，8mol/L尿素，1mmol/L DTT，1×Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free]裂解細胞。取20μg細胞裂解物進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，產物轉至PVDF膜后使用BSA封閉液[PBS中含1%牛血清白蛋白，0.2% (w/v) Triton X-100]室溫封閉30min。按照1∶40000稀釋Streptavidin-HRP于BSA封閉液，4℃過夜孵育。在室溫下PBS洗膜3次去除未結合的抗體，使用ABS封閉液[PBS中含10%牛血清白蛋白，1% (w/v) Triton X-100]封閉5min。PBS洗膜3次后，使用Millipore Immobilon Western試劑盒檢測生物素標記的蛋白。

結 果

1.慢病毒載體的構建：參照圖1的構建路線，經測序驗證，獲得的慢病毒表達載體TurboID-YB1及TurboID-GFP的序列完全正確。

2.強力霉素可有效誘導TurboID與目的蛋白在細胞內的融合表達：不添加誘導劑強力霉素，細胞內檢測不到融合蛋白TurboID-YB1。隨著強力霉素使用濃度的增加，融合蛋白TurboID-YB1在細胞中的表達量呈現出明顯的遞增關系，僅使用0.125μg/ml便可誘導目的蛋白YB1的表達，且其表達量與HeLa細胞內源性表達的YB1蛋白接近(圖2)。

圖2 不同劑量的強力霉素誘導融合蛋白TurboID-YB1在HeLa細胞內的表達

為進一步驗證可誘導性這一特點，對照細胞(TurboID-GFP病毒侵染的HeLa細胞)進行了強力霉素誘導處理，結果顯示，不添加強力霉素時幾乎檢測不到GFP的表達，添加0.5μg/ml強力霉素處理可顯著提高目的蛋白GFP的表達(圖3)。

圖3 強力霉素可有效誘導對照細胞中GFP的表達綠色熒光，×200

3.TurboID系統可對目的蛋白及其鄰近的蛋白分子有效標記生物素：使用50μmol/L的生物素處理融合表達TurboID-YB1的HeLa細胞，并使用Streptavidin-HRP進行Western blot法檢測生物素標記的蛋白。處理15min后兩類細胞系中均檢測到了大量生物素標記的蛋白，同時隨著孵育時間的延長，被標記蛋白的數量逐漸增多。將實驗組細胞TurboID-YB1同對照組細胞TurboID-GFP中標記的蛋白進行對比后發現，實驗組細胞中可標記更多種類的蛋白，尤其是在相對分子質量>35kDa范圍內的條帶種類明顯較對照組增多(圖4)。

圖4 Western blot法檢測攜帶生物素標記的蛋白箭頭所指分別為融合表達的TurboID-GFP及TurboID-YB1蛋白

討 論

為研究生物體內蛋白質與蛋白質之間的相互作用，人們先后發展出了生化分餾技術、酵母雙雜交(yest two hybrid assay, Y2H)以及以免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)為代表的親和純化(affinity purification,AP)等研究方法，并在國際范圍內得到了廣泛應用。然而這些技術都存在一些固有缺陷：不容易捕捉瞬時或較弱的蛋白相互作用；需要過表達目的蛋白，因此并不能真實反映相關蛋白復合物在細胞內的真實情況；細胞裂解液往往會破壞目的蛋白在正常細胞內的真實分布等[2,6]。為彌補這些不足，以BioID和APEX為代表的鄰近蛋白質標記方法應運而生，其中BioID技術因其細胞毒性小、標記效率高、適用性廣等優點被大量采用。該技術于2012年被首次報道，至今已被超過100多篇研究用于解析細胞內的蛋白組成[6，7]。但該技術仍然存在一些限制因素，主要體現在標記時間過長(一般要>16h)，且標記效率不高，因此無法捕獲瞬時或相互之間結合力弱的蛋白質。為解決這些問題，先后衍生出了一系列改良型生物素連接酶，例如BioID2、BASU，但這些方法仍然無法從根本上解決這些問題[8，9]。Alice YTing科研團隊報道了一種新的BirA突變體——TurboID，只需簡單用生物素處理10min，便可獲得與傳統BioID類似甚至更高的生物素標記效率，徹底解決了制約BioID技術發展的瓶頸問題[4]。自首次報道以來短短1年時間內，已被多個研究團隊成功應用于植物及酵母等多個物種[10，11]。

本研究中筆者成功構建了可以融合表達TurboID及目的蛋白的病毒載體系統。與之前的報道類似，僅對細胞做生物素處理15min以上，便可在HeLa細胞內檢測到大量被生物素標記的蛋白質(圖4)[4]。另一方面，相對于最初報道的TurboID系統，本系統具有兩個突出的特點：(1)目的蛋白的表達量可以精確控制[4]：由于Tet-on系統的引入，TurboID及目的基因的融合表達完全受制于外加誘導劑——強力霉素濃度的高低，通過調整誘導劑的加入時間及使用濃度，可以精確控制目的基因的表達時間及表達量，獲得更貼近于生物體原本狀態的實驗數據(圖2)[5]。(2)細胞適用性更廣：TurboID及傳統的BioID多以質粒為載體，以293T細胞為研究對象，這主要是由于293T細胞具備質粒轉染效率高、外源基因表達量高、細胞生長旺盛等特點。相對于質粒系統，筆者構建的病毒載體系統以lenti-cas9載體為基礎，具備病毒包裝效率高、細胞適用性廣的優勢，可產生高效價的病毒，并廣泛應用于分裂或原代培養的細胞，而不僅僅局限于293T這一類細胞[12，13]。

綜上所述, 本研究建立的TurboID體系提供了一種新型的探測蛋白質相互作用和空間關系的方法，該方法可以應用到多種細胞及多個物種，操作簡便快速, 可精確控制目的蛋白的相對表達量，具有廣闊的應用前景。