血液與尿液中鉛形態化合物的HPLC-ICP-MS分析

吳書凡，駱如欣，張素靜，馬安德，馬 棟*

(1.南方醫科大學 公共衛生學院，廣東 廣州 510515；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063)

鉛是法醫毒物分析中關注度較高的無機毒物之一。其在自然界中分布廣泛，可在生物體內蓄積，且因其形態不同，毒性差異很大[1]。鉛的有機態毒性為無機態毒性的10～100倍,其中，有機鉛進入人體后在人體軟組織停留時間較長，通過各器官的吸收，可觸發癌變。人體內過量沉積鉛將導致神經系統的破壞和智力的明顯下降[2]。常見的有機鉛包括三甲基鉛(TML)、三乙基鉛(TEL)、四甲基鉛和四乙基鉛等，其中四甲基鉛和四乙基鉛不穩定，易降解為毒性更高的TML和TEL。由于四甲基鉛和四乙基鉛的檢測方法已有較多報道，本研究選擇TML和TEL進行形態分析。

目前，鉛形態的分析方法主要有紫外分光光度法(UV)[3]、原子吸收光譜法(AAS)[4]、質譜法(MS)及各種聯用技術，包括氣相色譜-原子吸收光譜法(GC-AAS)、氣相色譜-原子發射光譜法(GC-AES)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜法(GC-ICP-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)和毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜法(CE-ICP-MS)等[5-13]。其中，HPLC-ICP-MS因具有接口簡單、檢出限更低、線性范圍更寬、干擾少、前處理過程簡便且對待測樣品無損等優點而廣泛應用于鉛形態分析[11-13]。對于TML和TEL的研究主要集中于外暴露樣品，如環境水樣、土壤、海產品、動物組織等[13-17]，關于人體生物檢材中TML和TEL的研究主要針對血液、尿液中其中1種有機鉛或無機鉛[18-21]，而同時對血液和尿液中TML、TEL進行形態分析的研究報道較少。血液和尿液是毒物分析領域的常用檢材，因此建立人體血液、尿液中TML和TEL的分析方法對于鉛中毒的法醫學評價十分必要。

本文建立了血液和尿液中TML、TEL的HPLC-ICP-MS分析技術，所建方法準確、可靠、簡便，適用于法醫毒物分析領域中鉛形態的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

賽默飛ICAP RQ ICP-MS儀(賽默飛世爾科技公司)，Agilent 1200 HPLC儀(配有自動進樣器,安捷倫科技有限公司),Element A10 超純水處理系統(美國Millipore公司)，15 mL 聚丙烯試管(美國Corning公司)。36%～38%鹽酸(色譜級)，硫代硫酸鈉、乙酸銨、乙酸(優級純)，甲醇、苯(HPLC級)，TML、TEL標準溶液(1 000 μg/mL)，上述試劑均購于上海安譜公司。

1.2 溶液的配制

儲備液：用甲醇分別配制質量濃度為1 000 ng/mL的TML、TEL儲備液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

標準溶液：用甲醇將TML、TEL儲備液逐級稀釋配制成3、5、10、20、50、100、150、200、250、300、400、500 ng/mL的混合標準溶液。

1.3 前處理方法

血液：取200 μL血液置于聚丙烯試管中，加入300 μL去離子水和500 μL濃鹽酸，再加入4 mL苯溶液超聲萃取15 min，離心5 min(5 000 r/min)，取上清液約3.5 mL轉移至聚丙烯試管中，提取完上清液的血液中再加入4 mL苯溶液超聲萃取15 min，離心5 min(5 000 r/min)，取上清液約3.5 mL，合并兩次上清液后，加入5 mL硫代硫酸鈉，超聲30 min后，取下層溶液約2 mL至進樣小瓶中。

尿液：取900 μL尿液置于聚丙烯試管中，加入100 μL去離子水，隨后重復血液樣品的萃取和反萃取操作步驟。

1.4 色譜與質譜條件

HPLC條件：Agilent Zorbax Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)分析柱；流動相：A相為0.1 mol/L乙酸銨-0.1 mol/L乙酸，B相為甲醇；流速：0.4 mL/min；柱溫：室溫；進樣體積：20 μL；流動相洗脫條件：A相為55%，B相為45%。

ICP-MS 條件：RF入射功率為1 550 W，載氣為高純氬氣，載氣流速為0.64 L/min，輔助氣流速為0.8 L/min，采樣錐深度為5 mm，泵速為0.4 r/s，積分時間為0.2 s，測量時間為180 s。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

圖1 最佳色譜分離條件下TML和TEL的譜圖Fig.1 Chromatogram of TML and TEL under optimum separation conditions

2.1.1 色譜條件的選擇在流動相比例為35%A相和65%B相的條件下，考察了C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm)和C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)2種Agilent Zorbax Plus C18色譜柱對TML和TEL的分離效果。結果表明，使用前者作為分析柱時，TML和TEL不能分離，峰形很差；使用后者作為分析柱時，TML和TEL能分離，但分離度較差。因此選用C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)分析柱，并對流動相比例進行了優化。結果顯示，當流動相比例為55%A相和45%B相時，TML和TEL可良好分離，且峰形較好(見圖1)，TML和TEL的保留時間依次為265.8、332.4 s。優化的色譜條件如“1.4”所示。

2.1.2 前處理條件的優化取200 μL加入“1.2”中系列質量濃度混合標準溶液的血液、尿液樣品，分別加入1 mL正己烷、乙醚溶液，渦旋2 min后離心取上層溶液，利用氮吹進行揮干后加甲醇復溶，測定結果顯示，TML和TEL的提取回收率低于50%。而采用苯溶液超聲萃取2次，硫代硫酸鈉溶液進行反萃取的前處理方法，測定結果顯示，血液、尿液樣品中TML和TEL的提取回收率大于80%，因此實驗選擇此方法進行樣品前處理。

2.2 方法學驗證

2.2.1 選擇性分別對10個不同來源的空白血液、尿液樣品按已建立的方法進行分析，考察內源性物質是否對鉛形態化合物有干擾。結果顯示，10份不同來源的血液、尿液樣品經處理后，待測化合物對應的保留時間處均無內源性干擾峰出現，說明內源性物質不干擾鉛形態化合物的測定。

2.2.2 線性關系、檢出限與定量下限將“1.2”系列質量濃度的混合標準溶液添加至空白血液、尿液中，按“1.3”方法對樣品進行前處理后，采用HPLC-ICP-MS進行檢測。以TML和TEL的響應值(y，cps)與其質量濃度(x，ng/mL)進行線性擬合,以TML和TEL的峰強度信噪比(S/N)≥3倍時的質量濃度為檢出限(LOD)，S/N≥10且滿足精密度和準確度要求的樣品最低質量濃度為定量下限(LOQ)。結果表明，血液和尿液中2種鉛形態化合物分別在3～200 ng/mL和5～400 ng/mL質量濃度范圍內線性良好，相關系數(r2)不小于0.994；LOD為0.85～1.31 ng/mL，LOQ為3.00～5.00 ng/mL(見表1)。

表1 血液、尿液中2種鉛形態化合物的線性關系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of two lead compounds in blood and urine

2.2.3 準確度與精密度按“1.3”方法配制樣品溶液，選擇低、中、高3個濃度水平在空白血液、尿液中加入混合標準溶液，每個濃度水平平行6份，按照本方法進樣檢測。根據當日的標準曲線，同法連續測定4 d，計算準確度、日內精密度(n=6)和日間精密度(n=24)，以加標回收率表示準確度，相對標準偏差(RSD)表示精密度。

結果顯示，本方法在血液和尿液的加標回收率分別為85.3%～91.8%、85.8%～89.5%，日內RSD為1.8%～9.9%，日間RSD為1.9%～10%(見表2)，符合方法驗證學的要求。

表2 血液、尿液中2種鉛形態化合物的加標回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of two lead compounds in blood and urine

2.2.4 提取回收率及基質效應選取空白血液和尿液為基質，采用低、高兩個濃度水平(血液中為3、150 ng/mL，尿液中為5、300 ng/mL)，按“1.3”方法對樣品進行處理，分別以空白血液和尿液提取后、前添加混合標準溶液進樣測得的峰面積為A、B，對應質量濃度混合標準溶液進樣測得的峰面積為C，按照下式計算：基質效應=A/C×100%，提取回收率=B/C×100%。結果顯示，基質效應為88.3%～117%，提取回收率為85.3%～104%，說明本方法無明顯基質影響。

2.2.5 穩定性分別考察了低、中、高3個質量濃度的空白加標樣品(血液中為3、50、150 ng/mL，尿液中為5、150、300 ng/mL)的3次反復凍融穩定性(-20 ℃～25 ℃)及室溫穩定性(25 ℃放置24 h)，按“1.3”方法對樣品進行處理，采用本方法進行檢測。反復凍融穩定性考察結果顯示，血液、尿液樣品的RSD分別為3.1%～7.4%、1.9%～5.9%；室溫穩定性考察結果顯示，血液、尿液樣品的RSD分別為1.6%～8.5%、2.4%～6.3%。該結果符合要求，表明方法穩定性良好。

2.3 案例應用

采用本方法對一誤食洗鞋粉的幼童患者血樣進行檢測，經查詢洗鞋粉成分表得知主要成分含有鉛，故抽樣對總鉛和鉛形態化合物含量進行檢測。所取血樣中檢出TML和TEL，質量濃度分別為136、112 ng/mL。采用總鉛檢測方法[21]，檢出總鉛的質量濃度為742 ng/mL。

3 結 論

本文采用HPLC-ICP-MS聯用技術建立了血液和尿液中2種鉛形態化合物TML、TEL的分析方法。該方法前處理簡單，靈敏度高，線性范圍寬，可為血液和尿液中鉛形態分析提供參考。通過案例應用顯示，本方法可檢測人體中TML和TEL的含量，與總鉛檢測方法相結合，可用于樣品中總鉛和鉛形態化合物的檢測。