一種基于分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移發(fā)色團(tuán)的硫化氫熒光探針的合成及其生物成像研究

陽 茜，劉存飛，劉夢琴，唐斯萍，胡 萌，韓路嬌，唐東晴，谷 標(biāo)

(衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 功能金屬有機(jī)化合物湖南省高校重點實驗室，湖南 衡陽 421008)

硫化氫是生物體內(nèi)的重要氣體信號分子之一[1]。內(nèi)源性的硫化氫由某些特定酶，如胱硫醚β-合成酶、胱硫醚γ-裂解酶和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生[2]。細(xì)胞內(nèi)的硫化氫參與許多生理過程，包括血管擴(kuò)張、血管生成、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)、胰島素信號抑制和炎癥調(diào)劑[3]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)的硫化氫水平異常與阿爾茨海默病、唐氏綜合征、糖尿病、肝硬化等疾病有關(guān)[4]。因此，發(fā)展高靈敏、選擇性的方法用于細(xì)胞內(nèi)硫化氫的檢測和成像在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷方面具有重要意義。

傳統(tǒng)的硫化氫檢測方法主要有比色法、電化學(xué)分析、氣相色譜法等[5-8]，但這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作，且大多為破壞性檢測，很難實現(xiàn)生物體內(nèi)硫化氫的實時、原位檢測。相比之下，熒光探針方法具有操作簡單、靈敏性和選擇性高等優(yōu)點。結(jié)合熒光顯微成像技術(shù)，熒光探針可用于生物體內(nèi)目標(biāo)分析物的檢測和長期示蹤[9]。

近些年來，國外知名期刊相繼報道了一些用于硫化氫檢測的熒光探針[10-12]。這些探針根據(jù)硫化氫的特定化學(xué)反應(yīng)設(shè)計，通常分為以下3大類：(1)化學(xué)還原：利用硫化氫還原疊氮、硝基、羥胺、二硫化物或硒化物；(2)硫化物沉淀：利用硫化氫與有機(jī)銅復(fù)合物反應(yīng)形成硫化銅沉淀；(3)親核反應(yīng)：利用硫化氫的親核性與熒光探針發(fā)生邁克爾加成或者取代反應(yīng)等。硫化氫熒光探針的研制已取得了很大進(jìn)展，但尚有待改進(jìn)，如：(1)選擇性：細(xì)胞內(nèi)含有毫摩爾濃度范圍的谷胱甘肽和其他濃度范圍的半胱氨酸，這些生物硫醇通常對硫化氫的檢測產(chǎn)生干擾；(2)Stokes位移：大部分報道的硫化氫探針Stokes位移小(< 80 nm)，作為檢測探針時，容易受到內(nèi)濾效應(yīng)和自吸收的干擾，降低檢測靈敏度；作為成像探針時，易受生物樣品背景熒光的干擾，降低成像信噪比。因此，構(gòu)建一種選擇性高、Stokes位移大的硫化氫熒光探針尤為重要，同時也具有一定的挑戰(zhàn)性。

圖1 探針DHCD檢測硫化氫的機(jī)理示意圖Fig.1 Proposed mechanism for the reaction of DHCD with H2S

具有激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(Excited-state intramolecular proton transfer,ESIPT)性質(zhì)的化合物，由于存在“醇式-酮式”互變異構(gòu)現(xiàn)象，在構(gòu)建熒光探針中具有重要作用[13]。相比其他熒光化合物，ESIPT化合物最顯著的光學(xué)性質(zhì)是具有大的Stokes位移，可有效消除內(nèi)濾光作用和熒光自吸收效應(yīng)，增強(qiáng)目標(biāo)熒光和背景熒光之間的對比度，提高分子的靈敏度[14]?；谝陨峡紤]，本研究設(shè)計并合成了一種基于分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)發(fā)色團(tuán)的硫化氫熒光探針(簡稱DHCD,見圖1)。探針DHCD以2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮為ESIPT發(fā)色團(tuán)(簡稱DHOH，圖1)，以2,4-二硝基苯基醚為硫化氫的特異識別位點。雖然該探針本身沒有熒光，但在硫化氫與探針發(fā)生親核取代反應(yīng)后，識別基團(tuán)脫落，產(chǎn)生的游離ESIPT發(fā)色團(tuán)可引起熒光信號增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)探針DHCD在檢測硫化氫時展現(xiàn)較大的Stokes位移，高的靈敏度和選擇性。更重要的是，該探針具有良好的細(xì)胞滲透性和低毒性，能用于活細(xì)胞內(nèi)的硫化氫熒光成像。

1 實驗部分

1.1 試劑及設(shè)備

2′-羥基苯乙酮、4-二甲氨基苯甲醛、吡咯烷、2,4-二硝基溴苯、硫氫化鈉(NaHS，作為硫化氫的供體)購于安耐吉化學(xué)有限公司。乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸鉀等試劑購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮根據(jù)文獻(xiàn)報道方法合成[15]。超純水(≥ 18 MΩ·cm)由Milli-Q純化系統(tǒng)制備。

化合物的氫譜和碳譜經(jīng)Bruker AVANCE-500M型核磁共振儀測得。紫外光譜和熒光光譜分別用UV-2501型紫外可見分光光度計(Shimazu Co,Japan)和RF-5301PC型熒光分光光度計(Shimazu Co,Japan)測定。細(xì)胞熒光成像實驗在倒置熒光顯微鏡(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)上進(jìn)行。

1.2 探針DHCD的合成與表征

將2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮(133 mg,0.5 mmol)，2,4-二硝基溴苯(134 mg,0.55 mmol)和碳酸鉀(137 mg,1 mmol)溶解于10 mL DMF，常溫下反應(yīng)2 h后倒入冰水中，收集沉淀物，用甲醇重結(jié)晶后得到黃色固體DHCD(145 mg,67%)。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ8.82(d,J=2.8,1H),8.40(dd,J=9.3,2.8,1H),7.82(dd,J=7.7,1.5,1H),7.71(td,J=8.1,1.6,1H),7.52(dd,J=17.1,8.2,3H),7.43～7.36(m,2H),7.11(d,J=9.3,1H),7.04(d,J=15.7,1H),6.68(d,J=8.9,2H),2.99(s,6H)；13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ190.27,155.72,152.69,151.02,147.22,141.64,139.17,133.64,133.27,131.27,131.10,130.00,127.41,122.62,122.29,121.66,119.86,119.05,112.15,101.64,40.10。

1.3 樣品配制與測試

用分析天平稱取一定量的探針DHCD溶解在DMSO中，配成濃度為1.0 mmol/L的DHCD標(biāo)準(zhǔn)液，保存在4 ℃冰箱中待用；分別稱取一定量的NaHS和其他分析物質(zhì)(金屬鹽、生物硫醇等)溶解在超純水中，配成濃度為1.0 × 10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，保存在4 ℃冰箱中待用。向測試管(2 mL)中加入探針DHCD儲備液(20 μL)和適量的分析物標(biāo)準(zhǔn)液，用磷酸鹽(PBS)緩沖液(10 mmol/L，pH 7.45)定容至刻度線處。待混合液孵育75 min后，在熒光分光光度計上測定熒光強(qiáng)度，熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為382 nm，記錄450～675 nm之間的發(fā)射光譜。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與成像

將HeLa細(xì)胞接種在96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，含5% CO2)中，用10%小牛胚胎血清的DMEM(杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h。然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有DHCD(10 μmol/L)的培基中，孵育30 min后用PBS洗滌2～3次，作為空白組。將一部分經(jīng)DHCD處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有NaHS(200 μmol/L)的培基中，孵育75 min后用PBS洗滌2～3次，作為實驗組。最后，用倒置熒光顯微鏡(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)觀察并拍攝兩組細(xì)胞的圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 可行性研究

在合成探針DHCD后，測試探針與NaHS作用前后的紫外吸收光譜和熒光光譜，證明探針識別硫化氫的可能。如圖2A所示，探針在348 nm處有一個最大吸收峰，該峰歸因于探針分子結(jié)構(gòu)中的π-π*電子躍遷，而在加入NaHS后，溶液的紫外吸收光譜發(fā)生紅移，在382 nm處產(chǎn)生最大吸收峰，表明溶液中有新物質(zhì)產(chǎn)生。圖2B為探針與NaHS作用前后的熒光光譜，在382 nm光激發(fā)下，探針的熒光較弱(Ф=0.048)；而在加入NaHS后，溶液在513 nm處的熒光信號明顯增強(qiáng)(Ф=0.375)，這可能是因為探針結(jié)構(gòu)中的2,4-二硝基苯在NaHS作用下脫去，導(dǎo)致熒光恢復(fù)。此外，探針與硫化氫作用后，Stokes位移高達(dá)165 nm，在生物分析中，如此大的Stokes位移可有效減少內(nèi)濾作用，降低自發(fā)熒光的干擾，提高檢測的靈敏度和成像的分辨率。

圖2 探針DHCD與NaHS作用前后的紫外吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.2 Absorption(A) and fluorescence(B) spectra of probe DHCD(10 μmol/L) without and with NaHS(200 μmol/L) in PBS-DMSO buffer(99∶1,by volume,pH 7.45)

圖3 探針DHCD與不同濃度NaHS作用后的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of DHCD(10 μmol/L) upon addition of different concentrations of NaHS PBS-DMSO buffer(99∶1,by volume,pH 7.45)

2.2 檢測機(jī)理

為了確定探針與硫化氫的作用機(jī)理，測試了探針DHCD與NaHS作用前后的核磁氫譜。在探針與NaHS作用前，2,4-二硝基苯基上的3個質(zhì)子信號峰位于8.8、8.3、7.7 ppm，而在加入NaHS之后，這3個質(zhì)子信號峰消失，同時在13.2 ppm處新出現(xiàn)1個歸屬于酚羥基的特征質(zhì)子信號峰，表明探針DHCD與硫化氫發(fā)生巰解反應(yīng)，釋放出熒光基團(tuán)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[16-17]，推測探針DHCD檢測硫化氫的可能機(jī)理如圖1所示。

圖4 探針DHCD(10 μmol/L)與不同物質(zhì)(200 μmol/L)作用前后的熒光強(qiáng)度矩形圖Fig.4 Fluorescence responses of DHCD(10 μmol/L) for various analytes(200 μmol/L) black bars represent the addition of a single analyte,red bars represent the subsequent addition of NaHS(200 μmol/L) to the mixture；SCN-,CH3COO-，respectively

2.3 靈敏度

為了探究探針的靈敏度，測試了DHCD(10 μmol/L)與不同濃度NaHS(0～200 μmol/L)在PBS-DMSO緩沖液(99∶1,體積比,pH 7.45)中的熒光光譜。從圖3可知，探針的熒光強(qiáng)度隨著NaHS濃度的增加而增加。更重要是，探針DHCD在513 nm處的熒光強(qiáng)度與NaHS的濃度在0～10 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系：Y=0.141 4+0.006 4X,r2=0.997 5(X為NaHS濃度，μmol/L，Y為歸一化熒光強(qiáng)度)。根據(jù)檢出限計算公式(LOD=3σ/k，σ為空白樣品連續(xù)測定11次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)[18]，求出當(dāng)前方法對硫化氫的檢出限為0.84 μmol/L，該值遠(yuǎn)低于正常人體內(nèi)硫化氫的含量[19]。上述結(jié)果表明探針DHCD對硫化氫具有較高靈敏度，并能通過熒光光譜定量檢測體外硫化氫的含量。

2.4 選擇性

除靈敏性外，選擇性也是評價探針優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。為證明DHCD對硫化氫的專一性，對探針與其他物質(zhì)(生理相關(guān)的陽離子、陰離子、硫醇)的熒光響應(yīng)情況進(jìn)行研究。如圖4所示，在NaHS存在下，探針產(chǎn)生明顯的熒光增強(qiáng)信號，而在其他物質(zhì)存在下，探針的熒光幾乎不變。更重要的是，這些被測試的物質(zhì)很難干擾探針對NaHS的檢測。上述實驗結(jié)果表明DHCD對硫化氫具有良好的選擇性和抗干擾性，滿足生物樣品中硫化氫的檢測要求。

2.5 熒光顯微成像

鑒于DHCD在體外實驗中對硫化氫優(yōu)良的識別性能(Stokes位移大、靈敏性和選擇性高)，利用DHCD對細(xì)胞內(nèi)的硫化氫進(jìn)行熒光成像。如圖5所示，將HeLa細(xì)胞與DHCD(10 μmol/L)孵育30 min后，細(xì)胞內(nèi)觀察不到熒光信號(圖5B)。然而，將細(xì)胞放置在含有NaHS(200 μmol/L)的培基中，孵育75 min，可以看到細(xì)胞內(nèi)有明亮的綠色熒光產(chǎn)生(圖5D)。從圖5A和圖5C可以觀察到，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，這說明DHCD具有較好的生物相容性和低的細(xì)胞毒性。上述實驗證明本研究中的探針具有較好的細(xì)胞膜通透性，適合機(jī)體中硫化氫的成像分析。

3 結(jié) 論

本研究制備了一種基于分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移發(fā)色團(tuán)的硫化氫熒光探針(DHCD)，該探針與硫化氫作用后展現(xiàn)明顯的熒光“關(guān)-開”變化，同時伴隨大的Stokes位移。光譜分析表明DHCD對硫化氫具有較高的靈敏度和選擇性，且不受其他生理相關(guān)物質(zhì)的干擾。更重要的是，該探針具有良好的生物相容性，可用于活細(xì)胞中硫化氫的熒光成像。因此，本工作為深入研究機(jī)體內(nèi)硫化氫的生理及病理作用提供了一種強(qiáng)有力的分析方法。

圖5 HeLa細(xì)胞與DHCD(10 μmol/L)孵育30 min后的明場圖(A)及熒光成像圖(B)，經(jīng)DHCD處理的HeLa細(xì)胞與NaHS(200 μmol/L)繼續(xù)孵育75 min后的明場圖(C)及熒光成像圖(D)Fig.5 Bright field image(A)and fluorescence image(B)of HeLa cells after being treated with DHCD(10 μmol/L) for 30 min， and bright field image(C) and fluorescence image(D) of HeLa cells preincubated with DHCD(10 μmol/L) for 30 min and then incubated with NaHS(200 μmol/L) for 75 min