基于Au@Ag納米顆粒的表面增強拉曼檢測血漿中的法莫替丁

臧穎超，朱慧敏，范夏瓊，張志敏，盧紅梅

(中南大學 化學化學工學院，湖南 長沙 410083)

法莫替丁(FMD)是第三代H2受體拮抗劑，對胃酸分泌有明顯的抑制作用，臨床上主要用于治療十二指腸潰瘍和上消化道出血[1]。目前，法莫替丁的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、伏安法[6]和分光光度法[7]等，其中，色譜法需昂貴的儀器設備，且前處理復雜、費時，不能實現對大量樣本的快速檢測；而伏安法和分光光度法雖然前處理簡單，但其抗干擾能力較低。因此，有必要開發簡便、快速、靈敏的法莫替丁檢測方法。

表面增強拉曼光譜(SERS)因具有無損、快速、高靈敏度和高選擇性等特點，廣泛應用于藥物[8]、生物[9]、環境[10]和食品[11]等領域，其基底是影響SERS信號增強效果的一個重要因素。銀納米粒子(AgNPs)和金納米粒子(AuNPs)是常用的SERS基底。AgNPs具有較好的SERS活性，但不穩定，易在空氣中被氧化。AuNPs雖具有良好的穩定性，但增強效果比AgNPs弱。因此，探究同時具有高SERS活性和較好穩定性的納米材料非常必要。由于金和銀具有晶格相匹配的特性，以金-銀核殼納米材料作為SERS的基底近年來受到關注[12]。與單獨的AuNPs或AgNPs相比，核殼Au@Ag納米粒子(Au@AgNPs)既保持了AgNPs良好的SERS活性，又具有AuNPs的穩定性和均勻的形貌[13]。本文通過種子生長的方法合成Au@AgNPs，并將其作為表面增強拉曼光譜的基底用于檢測法莫替丁，為藥物檢測提供了快速、簡便的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-1800紫外可見吸收光譜儀(島津公司)；S-4800場發射電子顯微鏡(SEM)(日立公司)；透射JEM-1400 Plus電子顯微鏡(JEOL公司)；Empyrean銳影X射線衍射儀(帕納科公司)；i-Raman便攜式拉曼儀器(B & W Tek公司)；原子型1810a摩爾超純水機(上海摩勒科學儀器有限公司)。

硝酸銀、氯金酸、檸檬酸三鈉和法莫替丁購自中國上海Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸和羅丹明6G(R6G)購自上海泰坦科技有限公司；所用化學試劑均為分析純。實驗用水為自制超純水(18.2 MΩ·cm)。

圖1 Au@AgNPs的合成及對法莫替丁的檢測Fig.1 Synthesis of Au@AgNPs and its detection for famotidine

1.2 Au@AgNPs的制備

通過種子介導的方法合成了Au@AgNPs[14]。AuNPs種子的合成：將125 μL(0.1 mol/L)的HAuCl4稀釋至50 mL水中，加熱至沸騰，攪拌并快速加入750 μL(1%)檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱攪拌30 min，獲得金種子溶液。Au@AgNPs的制備：取3 mL AuNPs作為種子溶液，加入450 μL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，邊攪拌邊逐滴加入1.35 mL AgNO3溶液(10 mmol/L)。在此過程中，可觀察到溶液的顏色由酒紅色變為橙色，表明金核的外層已成功地生長了一層銀。Au@AgNPs的合成及對法莫替丁的檢測見圖1。

1.3 樣品制備

標準溶液：取一定量法莫替丁標準品用水配成濃度為1×10-2mol/L的標準儲備液，再逐級稀釋為1×10-7～1×10-4mol/L系列濃度的法莫替丁標準溶液。

血漿樣品：先用水稀釋血漿以減少基質效應的干擾，然后向稀釋后的血漿中加入不同濃度的法莫替丁標準溶液，配成不同濃度的法莫替丁(0.45～250 μmol/L)血漿樣本。

1.4 光譜檢測

將100 μL法莫替丁標準溶液與100 μL的Au@AgNPs溶液混合，取一定量混合液滴于硅膠板上，調節合適的激光和待測樣表面距離以得到理想的光譜。光譜采集參數：激光波長785 nm，積分時間為30 s，物鏡倍數20倍，光譜采集范圍為200～4 000 cm-1。

圖2 金種子(紅線)和金核銀殼納米粒子(黑色)的紫外可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of Au seeds(red line) and core-shell Au@Ag nanoparticles(black line)

2 結果與討論

2.1 基底的表征

由AuNPs和Au@AgNPs的紫外可見吸收光譜圖可見，AuNPs在525 nm處具有很強的吸收峰(圖2)。當Ag在Au核上形成Ag殼，得到Au@AgNPs后，金核的吸收峰藍移至480 nm，并在390 nm處出現了一個銀殼的吸收峰。這是由于Ag和Au具有不同的等離子體共振頻率，兩者間發生了重疊和耦合。

采用SEM和TEM對合成的Au種子和Au@AgNPs的形貌進行了分析(圖3)，由圖3(A，B，D，E)可見，AuNPs和Au@AgNPs主要是以球形均勻分布。通過粒徑軟件分析表明Au種子的平均粒徑為27.94 nm(圖3C)，金核表面沉積的銀殼平均厚度為8.08 nm(圖3F)。

AuNPs和Au@AgNPs的XRD譜圖見圖4A，圖中38.2°、44.3°、64.5°、77.5°和82.5°分別對應于面心立方的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)[15]。由于金和銀的晶格常數相似[16]，因此峰的位置相同，很難通過衍射峰的位置比較AuNPs和Au@AgNPs，但可看出Au@AgNPs的峰更強。經高分辨率TEM分析可得Au@AgNPs的兩個相鄰晶格的晶面間距為0.234 nm(圖4C)，接近Ag的(111)平面晶格，且Ag納米晶體主要沿(111)方向生長[15]。

圖3 AuNPs(A、B、C)和Au@AgNPs(D、E、F)的掃描電鏡、透射電鏡、粒徑統計Fig.3 SEM,TEM and statistical histogram of particle size of AuNPs(A,B,C) and Au@AgNPs(D,E,F)

圖4 AuNPs和Au@AgNPs的XRD及TEM圖Fig.4 XRD and TEM of AuNPs and Au@AgNPsA:XRD of AuNPs and Au@AgNPs;B:TEM diffraction spot of Au@AgNPs;C:high-resolution TEM image taken from the Ag shell area of core-shell Au@AgNPs

圖5 Au@AgNPs(A)和法莫替丁粉末(B)的拉曼光譜及法莫替丁吸附在Au@AgNPs上的SERS光譜(C)Fig.5 Raman spectra of core-shell Au@AgNPs(A) and FMD powder(B),SERS spectrum of FMD adsorbed on the Au@AgNPs substrate(C)

2.2 法莫替丁的拉曼分析

法莫替丁、Au@AgNPs的拉曼光譜以及SRES光譜如圖5所示，其特征峰的歸屬見表1。從圖中可見，法莫替丁的拉曼特征峰主要位于547、685、739、972、1 009、1 122、1 241、1 333、1 435、1 540 cm-1處，與已有文獻報道的結果一致[17]。但由于分子和基底之間的取向和作用力的不同，可看到一些峰發生紅移或藍移[18]。法莫替丁的主要特征峰歸屬于CN的平面彎曲振動(549 cm-1)、CH2的扭轉振動(1 134 cm-1)、CS的拉伸振動和平面振動(1 325 cm-1)、CN的拉伸振動和NH2的形變振動(1 540 cm-1)。法莫替丁分子與Ag殼通過Ag-N鍵之間的相互作用吸附在Ag殼的表面。在入射光激發下，Au@AgNPs表現出強烈的表面等離子體共振特性，具有很強的局域電場，使得處于該電場中的法莫替丁分子的信號被增強。與常規的拉曼光譜相比，SERS光譜中1 540 cm-1處的峰信號增強顯著，且受到的干擾小，因此選其為特征峰用于后續分析。

2.3 Au@AgNPs的增強因子

增強因子(EF)是評價基底的SERS性能的重要因素之一，為了測試Au@AgNPs作為基底的增強性能，以R6G為探針分子，根據公式[18]計算增強因子：EF=(ISERS×CRaman)/(IRaman×CSERS)，式中IRaman和ISERS分別為1 363 cm-1處增強前、后的拉曼強度，CRaman和CSERS為增強前、后R6G的濃度，計算得EF為6.66×105，由此可見，Au@AgNPs有較高的EF值，具有檢測較低濃度法莫替丁的潛力。

表1 法莫替丁的拉曼光譜和SERS光譜中主要特征峰的歸屬Table 1 Band assignment of major peaks in the normal Raman spectrum and SERS spectrum of FMD

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圖6 不同濃度法莫替丁的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of FMD with different concentrations

2.4 法莫替丁的定量檢測

以Au@AgNPs為基底，檢測了不同濃度(0、0.4、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 μmol/L)的法莫替丁標準溶液，由其SERS光譜圖可知，隨著法莫替丁濃度的降低，1 540 cm-1處特征峰的強度也隨之降低(圖6)，當濃度低至0.4 μmol/L時，仍可看到明顯的特征峰。由于法莫替丁中不同的官能團在基底表面的吸附和取向不同，隨著法莫替丁濃度的降低，不同特征峰的強弱變化不同。法莫替丁濃度的對數(x)在0.5～50 μmol/L范圍內和1 540 cm-1處峰強度的對數(y)呈現良好的線性關系，線性方程為y=4.720 5x+0.249 1，相關系數(r2)為0.978，以公式LOD=3Sb/b[19]計算檢出限(LOD)，其中Sb為特征峰1 540 cm-1處空白樣SERS強度的標準偏差，b為建立的校準曲線的斜率，計算得到LOD為4.18×10-8mol/L。

2.5 血漿中法莫替丁的檢測

為評估本方法在實際樣本中的可行性，將法莫替丁溶液加入稀釋的血漿樣品中，然后與Au@AgNPs混合，考察了稀釋血漿中不同濃度(0、0.45、2.5、4.5、25、45、250 μmol/L)法莫替丁的SERS光譜。結果顯示，空白血漿光譜中無組分干擾法莫替丁的識別，稀釋血漿中法莫替丁的SERS光譜強度(1 540 cm-1)隨其濃度的降低逐漸減弱，峰強度的對數(y)與對應濃度的對數(x)在0.45～250 μmol/L范圍內具有良好的線性關系，線性方程為y=4.331 8x+0.218 8，r2=0.975，計算得LOD(3Sb/b)為1.11×10-7mol/L。由此可見，制備的Au@AgNPs可用于血漿中法莫替丁的快速檢測。

2.6 回收率及相對標準偏差

向血漿中加入一定量法莫替丁考察方法的準確性，加標濃度為2.5、25、250 μmol/L，每個濃度平行實驗3次，在優化條件下測定。計算得3個加標濃度下法莫替丁的回收率為91.6%～122%，相對標準偏差(RSD)為6.6%～12%，方法準確可靠，可滿足血漿中法莫替丁的測定要求。

2.7 Au@AgNPs重現性及選擇性

SERS信號的重現性是評價基底性能和SERS方法實際應用的一個因素，實驗隨機檢測了12批次法莫替丁，計算得其在1 540 cm-1處強度的RSD為9.5%，表明Au@AgNPs作為SERS基底檢測法莫替丁具有良好的重現性[15]，可用于實際樣品檢測。

3 結 論

本文建立了以Au@AgNPs為SERS基底的快速靈敏檢測法莫替丁的方法。結果表明，以Au@AgNPs檢測法莫替丁標準溶液，方法在0.5～50 μmol/L范圍內具有較好的線性關系，r2為0.978，LOD為4.18×10-8mol/L。使用Au@AgNPs對稀釋血漿中的法莫替丁進行SERS檢測，線性范圍為0.45～250 μmol/L，r2為 0.975,LOD為1.11×10-7mol/L,加標回收率為91.6%～122%。所建立的方法可用于生物樣品中法莫替丁的快速靈敏檢測。