基于G-四鏈體-血紅素和鏈式放大反應的基因檢測傳感器的構建

孫延修，孫笑凡

(1.沈陽工學院 基礎課部，遼寧 撫順 113122；2.無錫藥明生物技術股份有限公司，江蘇 無錫 214122)

隨著醫學的發展，DNA檢測在病原分析[1]、遺傳病診斷[2]和法醫鑒定[3]中發揮著重要的作用。截止目前，已有不同技術被用于DNA檢測，如電化學[4-6]、電化學發光[7]、化學發光[8]、表面等離子體共振技術[9]等。在上述技術中，電化學DNA傳感器具有高靈敏度、高選擇性、簡單易小型化等突出特點，因此被廣泛應用于不同場景。

為了在電化學檢測過程中獲得足夠的靈敏度，選擇合適的信號放大策略顯得尤為重要。常用的信號放大技術有基于納米材料的技術和基于DNA的擴增技術。前者通常利用各種納米材料作為信號標簽的載體，高負載信號標簽利用納米材料的高比表面積提供了有效的放大檢測信號[10]。然而，納米材料的穩定性有時并不令人滿意，且制備納米材料的步驟也很繁瑣。后一種技術包括聚合酶鏈反應、雜交鏈反應、鏈置換擴增、滾動循環擴增等，在酶催化下或無酶情況下將基于DNA雜交和擴增反應的輸出信號進行擴增。聚合酶鏈反應需要特定酶來實現目標基因的快速合成和擴增；鏈置換擴增需要DNA聚合酶在引物的作用下形成新的DNA長鏈，以替代目標基因;滾動循環擴增以環狀DNA為模板，在DNA聚合酶的催化下，延伸出大量的補體重復DNA序列。后兩種擴增技術均涉及DNA聚合酶，但酶的某些反應條件限制了這類需要使用酶的DNA擴增技術的應用。而雜交鏈反應可在無酶情況下進行[11]，該反應以目標基因為誘發劑，通過合理的設計可以促進信號放大，提高檢測靈敏度[12]。雜化連鎖反應后，根據所用的標簽可產生不同的讀出信號，其中電化學檢測因具有上述突出的特點而受到廣泛關注。

G-四鏈體復合物是一種富含鳥嘌呤的DNA序列，在K+存在時可以折疊成空間結構，并與血紅素強烈結合形成G-四鏈體-血紅素復合物[13]。該類復合物具有標記相對容易、成本較低、抗水解和熱處理穩定性好、非特異性吸附低、電化學性質典型等特點。因此，以G-四鏈體結構插入血紅素組成的G-四鏈體-血紅素復合物成為生物傳感器中常用的信號標簽[14]。

本文制備了一種簡單、超靈敏的電化學DNA生物傳感器，以目標基因序列為例，傳感器將靶序列與輔助探針的雜交鏈反應耦合，形成可產生信號的G-四鏈體-血紅素復合物。合理設計的探頭觸發了信號放大過程，獲得了方法的高靈敏度和高特異性。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

6-巰基己醇(6-MCH，純度為97%)、血紅素(純度≥97%)，均購自Sigma-Aldrich公司；4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸鈉(HEPES，純度≥98%，生工生物科技有限公司)；其他化學物質為分析級，實驗用水均為超純水，所有寡核苷酸均由生工生物科技有限公司合成并純化。

用10 mmol/L PBS 緩沖液(pH 7.4，1 mol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2) 將寡核苷酸序列稀釋至100 μmol/L，寡核苷酸序列如下：

捕獲探針(C-DNA)：5′-HS-(CH2)6-TTTAGTACTGGTG-3′

輔助探針(A-DNA)：5′-AAATTGCTGCCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGCTTAGTACTGGTG-3′

目標基因：5′-GGCAGCAATTTCACCAGTACTA-3′

單堿基錯配目標基因：5′-GGCAGCAATTTGACCAGTACTA-3′

三堿基錯配目標基因：5′-GGCAGCAATTAGTCCAGTACTA-3′

斜體字母和下劃線字母為互補序列，粗體字母為不匹配的堿基。

1.2 金電極的制備與修飾

將金電極在氧化鋁粉末上打磨后，依次在水、無水乙醇、水中40 kHz超聲清洗2～3 min，清洗結束后將金電極插入0.5 mol/L H2SO4溶液中循環伏安法掃描活化，掃描范圍為-0.4 V～+1.5 V，掃描速度為100 mV/s，直至獲得穩定的CV圖。將處理后的金電極用水沖洗并用氮氣吹干；將合成的C-DNA(由生工生物科技有限公司合成)用10 mmol/L PBS緩沖液溶解，-20 ℃冰箱中保藏；將C-DNA用PBS緩沖液稀釋；將100 μL 0.3 μmol/L的C-DNA溶液倒扣至處理好的金電極上6 h，使得C-DNA在金電極表面形成自組裝單分子層；用2 mmol/L 6-MCH封閉金電極4 h，得到修飾有C-DNA的金電極；用水淋洗電極，氮氣吹干待用。

1.3 電化學DNA生物傳感器的制備

將上述修飾有C-DNA的金電極浸至100 μL反應體系中，室溫反應2 h；所述反應體系為：0.8 μmol/L A-DNA、一定濃度的目標基因、水及20 mmol/L PBS緩沖液。將200 μL G-四鏈體形成液(10 mmol/L HEPES，50 mmol/L KCl，1% 二甲亞砜，pH 8.0)倒扣至電極上，室溫下放置30 min，向G-四鏈體形成液中加入2 μL 20 mmol/L血紅素混勻，將反應液繼續倒扣至電極，室溫下放置1 h，水沖洗電極后，用于電化學檢測。

電化學檢測采用三電極系統，實驗所得金電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對電極；工作溶液為20 mmol/L HEPES緩沖液(20 mmol/L HEPES，20 mmol/L KCl，pH 8.0)，檢測前先通入氮氣30 min；檢測方法為差分脈沖伏安法(DPV)，掃描范圍-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取一系列不同濃度的目標基因其進行檢測，得到峰電流與目標基因濃度的關系曲線。

2 結果與討論

2.1 方法的檢測原理

本文采用的信號分子為G-四鏈體-血紅素復合物。設計了5′端連接有巰基(-SH)，且能與目標基因序列部分互補配對的C-DNA，其能與金電極通過Au-S鍵結合從而在金電極上進行自組裝。A-DNA通過其兩端的堿基與目標基因互補配對，而中間的堿基則能形成G-四鏈體結構。血紅素加入后形成的G-四鏈體-血紅素復合物通過其血紅素卟啉鐵的Fe2+、Fe3+之間的電子轉移產生可檢測的電化學信號，從而實現對目標基因的檢測。(見圖1)

圖1 基于G-四鏈體-血紅素復合物電化學檢測目標基因的原理圖Fig.1 Electrochemical detection principle of target DNA based on G-quadruplex-hemin complex

2.2 傳感器的電化學表征

圖2 不同修飾狀態下金電極在緩沖液中的EIS圖Fig.2 Characterization of the modification of the electrode by EISa：bare Au electrode;b：C-DNA modified Au electrode;c：6-MCH blocked capture probe modified Au electrode;d：after hybridization with the target DNA

圖3 修飾C-DNA與6-MCH后金電極在不同狀態下的DPV曲線Fig.3 DPV curves of C-DNA and 6-MCH modified Au electrode in different modification statusa.adding A-DNA and target DNA;b.adding target DNA and hemin;c.adding A-DNA and hermin;d.adding A-DNA,target DNA and hemin

圖2分別為裸金電極、 0.5 μmol/L C-DNA修飾后的金電極、2 mmol/L 6-MCH封閉后金電極、0.5 μmol/L目標基因雜交后金電極在鐵氰化鉀緩沖液中的EIS檢測圖。結果顯示，與裸金電極(曲線a)相比，C-DNA修飾后的金電極(曲線b)所產生的電阻值增加，表明C-DNA已成功固定；當修飾有C-DNA的金電極用6-MCH封閉后(曲線c)所產生的電阻值繼續增加；最后添加目標基因序列之后(曲線d)，其電阻值進一步增大，表明目標序列連接成功。這也證明傳感器的構建順利，與實驗原理相符合。表征結果說明所設計的傳感器可用于目標基因的檢測。

2.2.2 實驗原理的表征為了驗證所構建傳感器在原理上的可行性，即A-DNA能否引至金電極表面，同時折疊成G-四鏈體結構，并在血紅素分子存在時產生信號響應，設置了4種不同實驗條件進行DPV掃描。實驗結果如圖3所示：未加血紅素前幾乎無響應電流信號(曲線a)，說明此時即使金電極表面固定有G-四鏈體序列，但無血紅素存在時不能與金電極表面發生較明顯的電子交換；當固定有C-DNA的電極與A-DNA及目標基因作用并加入血紅素后(曲線d)，可觀察到在-0.36 V附近產生很大的電流響應，這表明A-DNA與血紅素聚合后生成了G-四鏈體-血紅素復合物。該復合物能與金電極表面發生有效的電子轉移，從而產生較大的電流響應值，表明血紅素對于電化學信號的產生是必須的；未加入A-DNA(曲線b)、目標基因(曲線c)的對照組雖能產生電流響應，但該電流響應遠遠小于曲線d，說明無A-DNA存在而僅有血紅素與C-DNA和目標基因作用、無目標基因作用而僅有血紅素與C-DNA和A-DNA作用時，血紅素雖能夠與金電極表面發生氧化還原反應，但其產生的電流響應遠遠小于存在G-四鏈體序列時的電流響應，其作為背景信號不會較大影響該傳感器對目標序列的檢測和表征。這也證明該傳感器的檢測與實驗原理相符，可用于目標基因的檢測。

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 C-DNA濃度的優化A-DNA濃度和目標基因濃度均為0.5 μmol/L，以DPV法分別考察了不同濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 μmol/L)C-DNA對DNA傳感器性能的影響。結果顯示，隨著C-DNA濃度的增加，其電流響應值也不斷增大，在濃度達到0.3 μmol/L時，電流響應值趨于平緩(圖4A)。因此，實驗選擇C-DNA的最佳濃度為0.3 μmol/L。

圖4 C-DNA(A)與A-DNA(B)濃度對DPV電流響應值的影響Fig.4 Effects of C-DNA(A) and A-DNA(B) concentrations on DPV current signals

2.3.2 C-DNA修飾時間的優化取A-DNA濃度為0.8 μmol/L、目標基因濃度為0.5 μmol/L、C-DNA濃度為0.3 μmol/L，考察了不同C-DNA修飾時間(2、3、4、5、6 h)對DPV電流信號的影響。結果顯示，隨著C-DNA修飾時間的不斷增加，傳感器的電流響應值隨之增大，在6 h后電流響應值趨于平衡并達到最大。這說明A-DNA連接在金電極表面上的量達到飽和時所需時間為6 h。因此，實驗選擇C-DNA的最佳修飾時間為6 h。

2.3.3 A-DNA濃度的優化取C-DNA濃度為0.3 μmol/L、目標基因濃度為0.5 μmol/L，考察了不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L)A-DNA對DPV電流信號的影響。結果顯示，隨著A-DNA修飾濃度的不斷增加，其電流響應值也隨之增大，且在濃度為0.8 μmol/L時電流響應值趨于平衡并達到最大值(圖4B)。因此，實驗選擇A-DNA的最佳濃度為0.8 μmol/L。

2.4 目標基因的檢測

為了考察所構建的傳感器對目標基因的檢測范圍和靈敏性，采用DNA傳感器對不同濃度的目標基因序列進行檢測。如圖5A所示，隨著目標基因序列濃度在0～1 000 pmol/L范圍內不斷增大，掃描得到的DPV電流響應值相應增加，在目標基因序列的濃度達到100 pmol/L后，其電流響應值趨于平衡，說明所構建的傳感器此時已達到檢測上限。由圖5B可以看到，在目標基因序列濃度為0.01～10 pmol/L范圍內，DPV電流響應(y，μA)與目標基因濃度(c，pmol/L)具有良好線性關系，其線性方程為：y=0.020lgc+0.189，相關系數(r2)為0.994 1，檢出限(S/N=3)為8 fmol/L。

圖5 目標基因在不同濃度下的DPV曲線(A)，以及檢測信號與目標基因濃度的關系曲線圖(B)Fig.5 DPV curves obtained in different concentration of target DNA(A) and relationship between DPV peak current and concentration of target DNA(B)concentration of target DNA(a-i):0,0.01,0.1,0.3,0.5,1.0,10,100,1 000 pmol/L;inset：linear relationship between peak current and logarithm of target DNA concentration

圖6 DNA傳感器對不同序列檢測電流值直方圖Fig.6 Histogram of the current response in the presence of different DNA

2.5 傳感器對目標基因檢測的特異性

為驗證傳感器的特異性，本文采用目標寡核苷酸序列的兩種突變體進行考察。在優化實驗條件下，得到所構建的傳感器對目標基因(完全互補配對的目標基因序列)及其突變序列(單堿基突變的目標基因、三堿基突變的目標基因)的DPV電流響應值(見圖6)。由圖可看出，所構建的傳感器對完全互補配對序列的電流響應最大，對單堿基突變和三堿基突變序列的電流響應值很小。上述結果表明傳感器具有良好的特異性。

3 結 論

本文構建了基于鏈式放大反應檢測目標基因的傳感器，在目標基因和血紅素存在下，可在電極表面引入大量信號分子，實現目標基因的靈敏檢測。該方法對目標基因濃度的檢測范圍為0.01～10 pmol/L，檢出限可達8 fmol/L。方法具有較好的選擇性，實驗結果令人滿意。