氮氟共摻雜熒光碳點的制備及其在核黃素檢測中的應用

張麗婷，高 杉，馬 榕，李寧波，喬 潔

(1.山西醫科大學 基礎醫學院 生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001；2.山西醫科大學 基礎醫學院 化學教研室，山西 太原 030001)

碳點(CDs)具有合成簡單、生物相容性好、毒性低、熒光明亮且易功能化等優點，是一種很有發展前景的納米材料[1]，已應用于生物成像[2-3]、光電催化[4-5]、光電器件[6-7]、生物傳感器[8-10]、染料降解[11]等領域。CDs的合成基本分為自上而下[12-14]和自下而上[15-17]兩種方法，其中水熱法因簡單、高效而備受青睞。近年來，為了拓寬CDs的應用領域，研究者提出了如表面鈍化[18]、官能團修飾[19]、金屬元素及非金屬元素摻雜[20-21]等諸多改進方法；如Xu等[22]采用檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉合成S-CDs用于檢測鐵離子；Luo等[23]以檸檬酸和尿素為原料采用水熱法合成氮摻雜碳量子點(NCQD)檢測姜黃素。

圖1 核黃素的結構式Fig.1 Chemical structure of riboflavin

核黃素(Vitamin B2，結構式見圖1)是人體中一種非常重要的化合物，廣泛參與機體各種物質和能量代謝[24-25]，核黃素缺乏將會引起皮膚粘膜損傷、疲勞、生長緩慢、尖銳性唇炎和貧血等問題[26-27]。目前用于檢測核黃素的方法有高效液相色譜法[28-30]、毛細管電泳法[31]、分光光度法[32]和電化學法[33]，但上述方法存在儀器昂貴復雜，需專業技術人員的操作，樣品預處理復雜，且靈敏度低、選擇性差等缺陷，相比而言，熒光光譜法簡單，快速，成本低，靈敏度高。

本研究以檸檬酸、L-賴氨酸和氟化鈉為原料采用水熱法合成了氮氟共摻雜碳點(NFCDs)，采用透射電子顯微鏡(TEM)、傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)、X-射線光電子能譜儀(XPS)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜對其結構、組成、性質進行了考察，并研究了溶液pH值、NFCDs的濃度、反應時間對核黃素含量檢測的影響，探討了檢測機制，為食品中微量核黃素的檢測提供了快速、靈敏的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100 型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；Bruker Tensor Ⅱ傅立葉紅外光譜儀(德國Bremen公司)；AXIS ULTRA DLD型X-射線光電子能譜儀(英國Kratos公司)；UV-2910紫外分光光度計、F-4500熒光分光光度計(日本日立公司)；pHSJ-3F型酸度計(上海壘固儀器有限公司)；FD-1D-50冷凍真空干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；Smart-N型超純水儀(力康生物醫療科技控股有限公司)；Olympus FV1000-MPE多光子激光掃描顯微鏡(日本奧林巴斯光學儀器公司)。

核黃素、檸檬酸、氟化鈉、L-賴氨酸、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na3PO4·12H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT,北京索萊寶科技有限公司)；無水乙醇(天津市天新精細化工開發中心)；所用試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 氮氟共摻雜碳點的制備與純化

精密稱取0.197 0 g檸檬酸、0.197 2 g賴氨酸和0.177 4 g氟化鈉于50 mL燒杯中，加入20.0 mL蒸餾水攪拌0.5 h至其完全溶解，再將上述溶液倒入50 mL反應釜中，于180 ℃加熱10 h，靜置冷卻至室溫，過0.22 μm微孔濾膜，收集濾液用截留分子量為500 D的透析袋透析48 h，得淺黃色溶液，再冷凍干燥得粉末狀NFCDs(產率15.3%)，備用。

1.3 核黃素的檢測

向10 mm的石英比色皿中加入120 μL 0.5 mg/mL的NFCDs溶液，再加入不同體積的1.0 mmol/L 核黃素溶液，用10 mmol/L的PBS(pH 7.8)溶液稀釋至2.0 mL，混勻，于室溫下反應10 min后，選擇激發波長為330 nm，掃描范圍350～640 nm，激發和發射的狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，測定混合溶液的熒光光譜。

1.4 樣品的處理

牛奶來自伊利，奶粉來自雀巢，檢測前用0.22 μm微孔濾膜過濾除去雜質，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，用10 mmol/L的PBS(pH 7.8)緩沖溶液稀釋100倍后使用。

2 結果與討論

2.1 NFCDs的表征

實驗采用檸檬酸、L-賴氨酸、氟化鈉合成NFCDs，通過優化獲得最佳反應溫度和反應時間分別為180 ℃和10 h，制得的NFCDs在水中分散性良好、外觀透明，呈現明亮的藍色熒光，TEM圖中可見NFCDs呈球形，且分散性很好，平均尺寸均小于10 nm(圖2A)；高分辨透射電鏡(HRTEM)圖中顯示NFCDs的晶格間距為0.23 nm(圖2A插圖)，表明NFCDs具有類石墨結構[34]，經統計計算得NFCDs的粒徑尺寸為1.2～4.8 nm，平均粒徑為3.3 nm(圖2B)。

圖2 NFCDs的TEM圖(A)及其粒徑分布圖(B)Fig.2 TEM(A) and size distribution(B) of the NFCDs insert:HRTEM image of NFCDs

圖3 NFCDs的FT-IR圖(A)、XPS圖(B)、紫外、熒光激發及發射圖(C)及其在不同激發波長下的熒光發射譜圖(D)Fig.3 FT-IR(A),XPS(B),UV-Vis absorption spectra and fluorescence excitation and emission spectra(C) and fluorescence emission spectra under different excitation wavelength spectra(D) of NFCDsinsert C:photograph of NFCDs aqueous solution under visible light(left) and UV light(365 nm)(right);insert D:corresponding normalized spectra

2.2 NFCDs的熒光穩定性

實驗考察了NFCDs在4 ℃下貯存不同時間的熒光強度及其在365 nm處輻射不同時間下的熒光強度。結果發現，貯存時間和紫外輻射對NFCDs的熒光強度幾乎無影響，表明NFCDs具有良好的熒光穩定性。

2.3 核黃素檢測條件的優化

2.3.1 pH值的影響實驗考察了PBS緩沖溶液體系pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、7.8、8.0、9.0、10、11)對核黃素檢測的影響。結果顯示，無核黃素時，隨著體系pH值的增加，NFCDs的熒光強度變化不大。但加入核黃素后，NFCDs的熒光強度顯著下降，且在pH值為7.8時，熒光強度比值F0/F425最大，靈敏度最高，因此實驗選擇pH 7.8的PBS緩沖溶液。

2.3.2 NFCDs質量濃度的影響實驗考察了不同質量濃度NFCDs(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)對核黃素檢測的影響。結果顯示，加入0.3 mg/mL NFCDs時，體系的響應靈敏度最高，因此實驗選擇NFCDs溶液質量濃度為0.3 mg/mL。

2.3.3 反應時間的影響研究發現，在NFCDs溶液中加入核黃素后，體系的熒光強度迅速降低然后升高，10 min后保持不變，因此選擇反應時間為10 min。

2.4 線性方程與檢出限

研究了不同濃度(0.0、5.5、8.0、10.5、13.0、15.5、18.0、20.5、23.0、25.5、29.0、31.5、34.0、36.5、39.0、41.5、46.5、51.5、56.5、61.5、66.5、71.5 μmol/L)核黃素對NFCDs熒光強度的影響。結果顯示，隨著核黃素濃度增大，425 nm處的熒光強度下降，而531 nm處的熒光強度上升(圖4A)，圖4B為F531/F425與核黃素濃度的標準工作曲線，其中F531與F425分別代表加入核黃素后NFCDs在波長為531 nm和425 nm處的熒光強度。由圖可見，核黃素濃度(x)在3.0～66.5 μmol/L范圍內與F531/F425(y)呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.046 06x-0.037 17，相關系數(r2)為0.992 3，以3倍信噪比計算得核黃素的檢出限為0.26 μmol/L。

圖4 不同濃度的核黃素對NFCDs的熒光光譜(A)及NFCDs相對熒光強度F531/F425與核黃素濃度的線性關系(B)Fig.4 Fluorescence spectra of NFCDs on the different riboflavin concentrations(A) and linear relationship curve between F531/F425 and the concentration of riboflavin(B)

2.5 干擾實驗

常見的陽離子、氨基酸、食品添加劑可能會對NFCDs的熒光強度產生影響，因此選擇常見的金屬鹽溶液、氨基酸和食品添加劑(MgCl2、NaCl、MnCl2、CaCl2、AlCl3、BaCl2、ZnCl2、NH4Cl、CoCl2、CdCl2、ZrCl4、Hg(NO3)2、LiNO3、PbCl2、AgNO3、Cr(NO3)3、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、KCl以及Trp、Thr、Phe、Ile、Lys、Glu、Pro、Gly、His、Ala、Met等)代替核黃素加入待測體系中，考察其對NFCDs熒光強度的影響。結果顯示，濃度等于100 μmol/L的上述陽離子、氨基酸及食品添加劑等對檢測核黃素(70 μmol/L)基本無影響，表明該熒光探針對核黃素具有良好的選擇性。

2.6 機理探討

本文通過核黃素(受體)的紫外吸收光譜、熒光發射光譜圖和NFCDs(供體)的熒光激發、發射光譜圖探討檢測機理。結果顯示，受體的紫外可見吸收光譜圖與供體的激發和發射光譜之間有一定的重疊，這將有利于熒光共振能量轉移(FRET)的發生[38]。在此過程，受體也是一種熒光發射體，核黃素對應的熒光發射峰波長為527 nm，由此可推斷531 nm處的熒光發射峰是由核黃素引起的(圖5A)。通過考察不同濃度(0、6.0、6.5、7.5、8.0 μmol/L)的核黃素對NFCDs紫外吸收光譜的影響(圖5B)發現，加入核黃素后，體系的紫外吸收在NFCDs的基礎上有所增加，但最大吸收峰的位置和形狀未發生變化，表明核黃素與NFCDs之間未生成新物質。故推斷核黃素與NFCDs間通過偶極-偶極耦合作用發生熒光共振能量轉移[38]，其相互作用如圖6所示。

圖5 核黃素的紫外吸收、熒光發射光譜圖和NFCDs的熒光激發、發射光譜圖(A)及不同濃度的核黃素對NFCDs紫外吸收光譜的影響(B)Fig.5 UV-Vis absorption spectra,fluorescence emission spectra of riboflavin and fluorescence excitation,emission spectra of NFCD(A) and UV-Vis absorption spectra of NFCDs solution in the presence of various concentrations of riboflavin(B)

圖6 核黃素與NFCDs相互作用示意圖
Fig.6 Schematic diagram of NFCDs for the detection of riboflavin

2.7 實際樣品檢測及加標回收率

采用本文構建的NFCDs熒光探針對實際牛奶和奶粉樣品中的核黃素進行測定，結果見表1。將不同濃度的核黃素加入牛奶和奶粉中進行加標回收實驗，在優化條件下平行測定3次，核黃素的回收率為96.7%～103%，相對標準偏差(RSD)為1.4%～3.2%，表明本方法可用于牛奶和奶粉中核黃素的檢測。

表1 牛奶和奶粉中核黃素的測定結果Table 1 Determination results of riboflavin in milk and milk powder

圖7 MTT測定NFCDs的細胞存活率Fig.7 Cell viability of HeLa cells in the presence of different concentrations of the NFCDs

圖8 NFCDs在HeLa細胞中的共聚焦熒光圖像在明亮的區域(A)、藍色通道熒光圖(B)以及NFCDs和核黃素在HeLa細胞中的共焦熒光圖像在明亮的區域(C)、藍色通道熒光圖(D)Fig.8 Confocal fluorescence image of HeLa cells were incubated with NFCDs in bright field(A),fluorescence image of blue channel(B),confocal fluorescence images of NFCDs and riboflavin in HeLa cells were incubated in bright fields (C),fluorescence image of blue channel(D)

2.8 細胞毒性測試

采用MTT法測定不同濃度NFCDs對HeLa細胞的毒性。取HeLa細胞在CO2培養箱中孵育，待細胞鋪滿瓶壁后，消化后傳代至96孔板，使用細胞計數板計錄細胞數目。過夜,待細胞貼壁，再加入不同質量濃度的NFCDs(0、10、40、80、200、300、400、500 μg/mL)，繼續培養24 h。用PBS洗滌3次，之后每孔加入20 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，放置在培養箱中繼續孵育4 h。再用PBS洗滌3次，在每孔中加150 μL的DMSO(二甲基亞砜)，室溫振蕩混勻15 min，用酶標儀測定。結果表明，NFCDs的質量濃度為500 μg/mL時，細胞的存活率高于80%(圖7)，表明NFCDs具有良好的生物相容性、低毒性，在活細胞中核黃素的監測方面具有巨大潛力。

2.9 細胞成像

HeLa細胞被置于35 mm，底部有10 mm孔的Petridish培養皿中，在RPMI-1640培養基中培養24 h。用PBS緩沖液洗滌后，HeLa細胞在37 ℃與0.4 mg/mL NFCDs孵育1.5 h，使細胞攝取。為了監測活細胞中核黃素濃度的變化，將細胞洗滌3次，加入60 μmol/L的核黃素，孵育15 min后進行熒光成像。圖8A為NFCDs與HeLa細胞孵育后在明亮區域的共聚焦熒光圖像，可見細胞形態正常，說明合成的NFCDs與HeLa細胞孵育后對細胞的毒性很小；HeLa細胞經過NFCDs孵育后呈現出藍色的熒光(圖8B)。經NFCDs孵育后，HeLa表現出強烈的藍色熒光，表明NFCDs能穿透細胞膜，通過內吞作用進入細胞；圖8C為NFCDs、核黃素與HeLa細胞共孵育后在明亮區域的熒光圖像。其細胞形態正常，說明合成的NFCDs、核黃素與HeLa細胞孵育后對細胞的毒性很小；當HeLa細胞、NFCDs和核黃素在37 ℃共孵育1.5 h后，采用激光共聚焦顯微鏡對HeLa細胞進行熒光顯微鏡觀察，未觀察到熒光(圖8D)。細胞的熒光消失，表明核黃素對NFCDs的熒光有猝滅作用。由此可見，合成的NFCDs既可用于細胞成像，也可用于細胞中核黃素的檢測。

3 結 論

通過一步水熱法制備得到具有明亮藍色熒光的NFCDs，量子產率為15.3%，該納米粒子平均粒徑為3.3 nm，生物相容性好，且NFCDs的相對熒光強度與核黃素的濃度呈良好的線性關系，濃度范圍3.0～66.5 μmol/L，檢出限為0.26 μmol/L。用于牛奶和奶粉實際樣品中核黃素的檢測，結果令人滿意。