基于質譜特征碎裂片段的乳制品中真菌毒素非定向篩查方法研究

賈 瑋，樊子便 ，杜 安，石 琳，許牡丹，儲曉剛,2

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

真菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中在一定環境下產生的二次代謝有毒產物，按產毒素的菌種主要分為曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮孢菌屬、麥角菌屬四大類，所產生的毒素主要包括黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮類、伏馬毒素類、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類、麥角堿類，飼料為養殖環節的主要污染源之一[1-2]。流行病學研究顯示，黃曲霉毒素B1與肝癌發生密切相關，已被國際衛生組織國際癌癥研究總署確認為A類致癌物質[3-4]。近年來，隨著我國乳品行業的發展和消費者食品安全意識的增強，乳品安全問題越來越受到關注，亟待發展真菌毒素的高通量非定向篩查分析方法[5]。

乳制品中真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)、色譜-質譜聯用法等[6]，其中酶聯免疫法具有特異性強、靈敏度高、前處理簡單、易于推廣等優點，但此法存在一定的假陽性與假陰性[7-9]。目前，我國頒布的《GB 5009.24-2016 食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》等真菌毒素檢測國家標準采用液相色譜-串聯質譜實現了食品中真菌毒素的準確定量分析，但受限于不同類別分析時色譜-質譜的差異，無法實現多類別真菌毒素的高通量定性定量分析[10-11]。因此建立乳制品中真菌毒素非定向篩查檢測方法具有重要的現實意義和應用價值，也符合國家食品安全發展方向[12-14]。超高效液相色譜-高分辨質譜將液相良好的分離能力、精確質量數與可提供溯源信息等優勢相結合，具有高通量、高選擇性、高靈敏度等優勢，適用于多種目標化合物的篩查和確證分析[15-16]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質譜的數據依賴型掃描模式，對38種典型真菌毒素標準物質化合物色譜信息、分子離子和二級碎裂片段進行采集，建立了真菌毒素標準數據庫并完成裂解途徑解析與特征碎裂片段篩選；采用數據非依賴掃描，獲取可追溯的樣品質譜信息，構建了乳制品中真菌毒素的非定向篩查方法。該方法具有前處理簡單、分析時間短、靈敏度較高以及定性定量可靠的優勢，可滿足乳制品中安全風險突發事件快速應急處理工作中高通量、高可靠性確證和定量分析的要求，能夠為企業及監管部門提供有力的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料與嬰幼兒配方乳粉購于當地超市；0.22 μm微孔濾膜(美國Pall公司)；C18吸附劑(粒徑為40～60 μm，60 ?平均孔徑)、PSA吸附劑(粒徑為40～60 μm，60 ?平均孔徑)、陶瓷均質石(美國Agilent Technologies公司)；無水硫酸鎂和無水乙酸鈉為優級純(美國Supelco公司)；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、甲酸銨均為色譜純，購自美國Sigma公司；38種真菌毒素標準物質購于英國LGC Standards公司和瑞士Fluka公司。

高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；Vortex.Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ED-115型恒溫干燥箱(德國Binder公司)；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Integral型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 標準溶液的配制

稱取真菌毒素標準品各1.0 mg(精確至0.01 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成單標儲備液，于-20 ℃避光保存。精密移取單標儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇-水(體積比1∶1)稀釋并定容，配成質量濃度均為1 mg/L的混合標準溶液，于-20 ℃棕色密閉瓶中避光保存。

1.3 樣品前處理

對于乳粉等粉狀樣品，稱取嬰幼兒配方乳粉3.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞聚苯丙烯離心管中，加入(45±5) ℃的超純水(20 mL)后渦旋振蕩使其充分混勻。分別稱取混勻的巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料和已溶解的嬰幼兒配方乳粉試樣各15 g(精確至0.01 g)，于50 mL具塞聚苯丙烯離心管中，加入10 mL乙酸-乙腈-水(體積比1∶84∶15)混合溶液，渦旋混合30 s后加入6.0 g無水硫酸鎂、1.45 g無水乙酸鈉與陶瓷均質石，再次渦旋30 s，振蕩提取1 min，然后在4 ℃以10 000 r/min離心5 min，移取8 mL上層溶液于預先加有405 mg C18、108 mg PSA及1.2 g無水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s,在4 ℃以10 000 r/min條件下離心5 min。移取上清液過0.22 μm有機系微孔濾膜，取200 μL濾液至2 mL進樣小瓶中后加入300 μL甲醇及500 μL 8 mmol/L甲酸銨水溶液，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質譜測定。

1.4 基質匹配溶液的配制

移取乳制品前處理提取液12份各5 mL于10 mL容量瓶中，氮吹至近干，分別加入真菌毒素標準品混合溶液10、20、40、80、100、200、400、800、1 000、2 000、4 000、5 000 μL于該容量瓶中，各加入5 mL甲醇后，用8 mmol/L甲酸銨水溶液定容，配成1.0、2.0、4.0、8.0、10、20、40、80、100、200、400、500 μg/L的基質匹配標準溶液，用于標準校正曲線的繪制。

1.5 分析條件

色譜條件：Accucore C-18 aQ預柱(10 mm×2.1 mm，1.9 μm)和Hypersil Gold C-18 aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)，柱溫：35 ℃；流動相：A為0.1%(體積分數)甲酸-4 mmol/L甲酸銨水溶液，B為0.1%(體積分數)甲酸-4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，100% A；1～7 min，100%～ 0% A；7～12 min,0% A；12～13 min，0%～100% A，13～15 min，100% A，流速為300 μL·min-1，進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子化(ESI)，采用正模式；鞘氣流速18 L/min，鞘氣壓力275 kPa，輔助氣流速3 L/min；毛細管電壓：正離子模式3 500 V；負離子模式3 000 V；離子源溫度：50 ℃；毛細管溫度：320 ℃。全掃描模式(Full scan)，分辨率設定70 000 FWHM，自動增益控制的目標值(AGC)定為1.0×107，容許質量誤差范圍5 ppm，最大注入時間250 ms，動態背景扣除(Dynamic exclusion)設定為10.0 s。

全掃描/數據依賴掃描模式(Full MS/dd-MS2)參數：分辨率為17 500 FWHM，自動增益控制的目標值定為5.0×106，出峰后的觸發時間(Apex trigger)為3～6 s，最大注入時間120 ms，動態背景扣除為10.0 s，選擇TOP 5模式。待碎裂的目標分析物在特定的信息列表(Inclusion list)中設定，容許質量誤差范圍設定為10 ppm。當待碎裂的離子響應強度達到強度閾值8.3×104時，即送往高能碰撞解離(HCD)碰撞池，通過3個不同的碰撞能量分別進行碰撞，最終疊加得到一張子離子譜圖，碰撞能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

可變的數據非依賴采集Variable Data Independent Acquisition(vDIA)參數：掃描時間0～15 min；自動增益控制的目標值設定為5.0×106，最大注入時間為120 ms；分辨率采用17 500 FWHM；信息列表分為：112.801 16、137.812 53、162.823 90、187.835 27、212.846 63、237.858 00、262.869 37、287.880 74、312.892 11、337.903 48、362.914 85、387.926 22、412.937 58、437.948 95、462.960 32、487.971 69、550.500 11、650.545 59、750.591 06、850.636 54，其中112.801 16～487.971 69設定為第一個vDIA掃描，隔離窗口范圍(Isolation window)設為25.0 Da，Loop Count設定為16(即16個掃描段)，550.500 11～850.636 54設為第二個vDIA掃描，動態背景扣除10.0 s，隔離窗口范圍設為100.0 Da，Loop Count設定為4。碰撞能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

2 結果與討論

2.1 數據庫的建立

同類真菌毒素分子存在結構及質譜碎裂方式的共性。將標準溶液逐級稀釋配成質量濃度為500 μg/L用于標準數據庫的信息采集。首先運用Full MS/dd-MS2掃描模式采集真菌毒素標準品的MS/MS譜圖。其次，從實驗譜圖中記錄各個碎片離子的分子離子主要離子化形式(響應最高)質荷比(理論值)、二級碎裂片段質荷比與保留時間等信息。基于每種真菌毒素的碎裂途徑和各個碎片離子間的相對強度，選擇豐度比較高且大于10%、同時可用于區分同類別化合物的碎片作為定量信息(表1)[17-18]。構建了MS/MS譜圖數據庫，數據庫包括黃曲霉毒素類(黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1)、赭曲霉毒素類(α-赭曲霉毒素、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素A)、玉米赤霉毒素類(β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉醇)、伏馬毒素類(伏馬毒素B3、伏馬毒素B2)、鐮刀菌毒素類(雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、葡萄糖苷化嘔吐毒素、鐮刀菌烯酮X、去環氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)、麥角堿類(田麥角堿、麥角克堿、麥角辛、麥角異柯寧堿、麥角異卡里堿、雙氫麥角汀)、其他類(黃綠青霉素、雜色曲毒霉素、鈣激活鉀通道阻斷劑、T-2四醇、青霉酸、T-2三醇、騰毒素、橘毒素、HT-2毒素)共38種真菌毒素的正、負離子掃描模式和多種加合物形式([M+H]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]-、[M-H]-)合計95張譜圖。

表1 38種真菌毒素的標準數據庫信息Table 1 Standard database information for 38 mycotoxins

(續表1)

No.CompoundCASMolecular formulaRetention time/minPrecursor(m/z)Ionization modeFragment 1(m/z)Fragment 2(m/z)28Penicilic Acid(青霉酸)90-65-3C8H10O45.0171.065 19[M+H]+C7H7O+3(139.032 56)C7H11O+2(127.077 89)293-Acetyldeoxynivalenol(3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)50722-38-8C17H22O75.4339.143 83[M+H]+C14H15O+3(231.101 13)C8H9O+2(137.059 81)3015-Acetyldeoxynivalenol(15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)88337-96-6C17H22O75.4356.170 38[M+NH4]+C16H33O+6(321.133 26)C13H15O+2(203.106 45)31T-2 Triol(T-2三醇)34114-98-2C20H30O76.3400.232 98[M+NH4]+C15H21O+5(281.137 91)C12H29O+3(221.113 32)32Ergocorninine(麥角異柯寧堿)564-37-4C31H39N5O56.5560.287 842 8[M-H]-C16H16N3O-(266.120 90)C16H15N3O-(265.120 41)33HT-2 Toxin(HT-2毒素)26934-87-2C22H32O86.8442.243 54[M+NH4]+C16H35O+6(323.110 48)C14H17O+3(233.110 71)34Ergocryptinine(麥角異卡里堿)511-10-4C32H41N5O56.8576.318 05[M+H]+C20H22N3O+(320.175 64)C16H18N3O+(268.138 12)35Beta-Zearalanol(β-玉米赤霉醇)42422-68-4C18H26O56.8323.185 30[M+H]+C18H27O+5(323.188 44)C12H13O+2(189.091 03)36Dihydroergocristine(雙氫麥角汀)17479-19-5C35H41N5O56.7612.318 05[M+H]+C21H24N3O+2(350.177 42)C16H20N3O+(270.166 59)37Tentoxin(騰毒素)28540-82-1C22H30O4N46.8413.219 43[M-H]-C10H+15(135.117 20)C9H+13(121.102 01)38Citrinin(橘霉素)518-75-2C13H14O56.4249.076 85[M-H]-C6H7O+5(159.028 32)C8H+13(109.102 29)

2.2 特征碎裂片段篩選及其在真菌毒素殘留篩查中的應用

圖1 黃曲霉毒素G1的四極桿-靜電場軌道離子阱質譜圖Fig.1 Quadrupole-orbitrap mass spectrum of aflatoxin G1

2.2.1 斷裂途徑與機理研究實驗研究了38種真菌毒素的碎裂機理，得到了所有片段的質譜裂解反應途徑。以黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1)為例，其dd-MS2譜圖如圖1所示。

圖2 黃曲霉毒素G1的碎裂機理示意圖Fig.2 Fragmentation mechanism of aflatoxin G1

表2 真菌毒素特征碎裂片段Table 2 Characteristic fragmentations of mycotoxins

2.2.3 特征碎裂片段在真菌毒素篩查中的應用將特征碎裂片段與真菌毒素標準數據庫相結合應用于乳制品中真菌毒素的非定向篩查。運用Full MS/vDIA掃描模式，采用表2中真菌毒素特征碎裂片段的精確質量數提取并分析呈正態分布的色譜峰；比對真菌毒素的標準數據庫信息，判斷該物質的歸屬類別之后通過其質荷比、同位素豐度比、片段豐度比等質譜信息及碎裂途徑，推斷其元素組成和分子結構式。最后利用標準物質的色譜質譜信息進行確證和定量。目標物濃度由乳制品中真菌毒素化合物與標準物質的峰面積比乘以標準物濃度計算而得。例如，在篩查乳及其制品中的真菌毒素時運用外源性風險物質特征碎裂片段m/z494.348 25提取出呈正態分布且在標準信息庫中沒有的色譜峰(其質譜圖見圖3)。通過質荷比、同位素豐度比、片段豐度比信息推斷該物質分子式為CxHyNOz,將豐度較高的片段與真菌毒素標準信息庫的其他化合物斷裂途徑進行對比，發現該未知化合物與伏馬毒素B2、伏馬毒素B3的碎裂片段斷裂機理相似(圖4)，通過對譜圖與標準物質比對分析，判斷該化合物為伏馬毒素B1，最終定量濃度為0.11 μg/kg。

2.3 基質效應

乳制品基質復雜，在電噴霧離子化模式下化合物的質譜響應易受基質干擾，因此實驗通過繪制純溶劑標準溶液和空白基質提取液匹配標準溶液的標準曲線來判斷基質效應的強弱。基質效應按公式計算：C%=(1-Ss/Sm)×100；式中，C%為基質效應；Ss為純溶劑配制的目標化合物標準曲線斜率；Sm為空白基質配制的目標化合物標準曲線的斜率。|C%|在20%以內為較弱基質效應，在20%～50%為中等基質效應，50%～100%為強基質效應。結果顯示，38種真菌毒素中大部分化合物存在基質效應，其中10.5%屬于中等強度的基質效應，86.8%為較弱基質效應，其余的少數真菌毒素屬于強基質效應。為盡量降低基質效應干擾，建立校準曲線時，混合標準溶液采用基質匹配法配制，以最大限度地消除基質效應對于靈敏度和準確性的影響。

2.4 方法學考察

方法學參數依據歐盟標準2002/657/EC[26]與SANCO/12571/2013[27]。結果表明，檢測方法中外源性風險物質在各自濃度范圍內呈良好的線性，相關系數(r2)均大于0.99。本實驗中檢出限與定量下限通過確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)進行考察和表征。CCα指等于和高于此值時，用α誤差概率計算得出，認為所測樣品不符合規定的結論限度；CCβ指用β誤差概率檢測、鑒別、定量得到的樣品中物質的最低含量，CCβ數值等于CCα取值時重現性標準偏差的1.64倍與CCα數值之和。CCα采用校準曲線法測定，向乳及乳制品基質中等距離梯度添加真菌毒素混合標準物質，分別以添加濃度與峰面積為坐標繪圖，CCα數值為可觀察到響應時縱坐標軸上的濃度值與對應的重現性標準偏差的2.33倍之和。計算得CCα和CCβ分別為0.01～0.36 μg/kg與0.03～0.57 μg/kg。在基質中添加低、中、高3個水平的真菌毒素系列混合標準物質溶液，經樣品前處理后，運用四極桿-軌道離子阱質譜檢測，計算得平均回收率與相對標準偏差(RSD)分別為81.9%～111%和1.1%～6.1%(表3)，所建立的方法準確性和精密度良好。

表3 巴氏殺菌乳中38種真菌毒素的線性范圍、確定限、檢測容量、相關系數、平均回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Linear ranges,decision limits,detection capabilities,correlation coefficients(r2),recoveries and RSDs of 38 mycotoxin in pasteurised milk(n=6)

2.5 實際樣品檢測

采用所建立的方法篩查40個批次巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料與嬰幼兒配方乳粉中的真菌毒素，其中一個巴氏殺菌乳樣品中檢出伏馬毒素B1，含量為0.11 μg/kg，未超過我國國家限量標準《GB 2761-2017 食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[28]。

3 結 論

本文建立了基于超高效液相色譜-四極桿-軌道離子阱質譜技術的乳制品中常見真菌毒素的快速識別和定量方法，使用dd-MS2與vDIA兩種二級掃描模式分析了真菌毒素特征斷裂片段，獲得了真菌毒素標準數據庫并完成裂解途徑解析和特征碎裂片段篩選，獲取了可追溯的樣品質譜信息，最終實現了乳制品中真菌毒素的非定向篩查。方法學考察及實際樣品的檢測證明該方法具有靈敏度高、選擇性強、質量精確度高的特點，方法的檢出限、回收率及精密度滿足國內外標準的要求，適用于多組分真菌毒素低含量殘留的定量檢測與定性確證，能夠為企業及相關安全監管部門提供有力的技術支撐。