合成基因IL-6在大腸桿菌中表達(dá)及融合蛋白鑒定分析

唐維政 孫鴻高 陳少文 汪凡 朱中元

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,海南 海口 570311)

臨床上對細(xì)菌引起的感染性疾病的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)菌培養(yǎng),但細(xì)菌培養(yǎng)周期長,一般3～5天才有結(jié)果,而且血培養(yǎng)陽性率低,還可能因污染菌造成假陽性。因此,僅靠細(xì)菌培養(yǎng)無法實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌引起的感染性疾病的早期診斷,受細(xì)菌感染的患者尤其是重癥患者也就不能及時(shí)得到抗生素治療。近年來,白細(xì)胞介素6(IL-6)、降鈣素原(PCT)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)等感染指標(biāo)的血清學(xué)檢驗(yàn)已越來越引起臨床的重視,成為了對感染性疾病早期診斷和鑒別診斷的新手段[1-4],有效地彌補(bǔ)了細(xì)菌培養(yǎng)周期長等缺陷。

目前,國內(nèi)已普遍采用免疫熒光法或免疫膠體金法快速測定PCT、CRP和SAA,以滿足急診患者診療需求。而IL-6的檢測主要為化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法,這兩種方法對于基層醫(yī)院和偏遠(yuǎn)地區(qū)小型醫(yī)院不適用。我們試圖開發(fā)一種IL-6、PCT、CRP和SAA膠體金聯(lián)合快速檢測系統(tǒng),為沒有先進(jìn)檢測設(shè)備的醫(yī)療機(jī)構(gòu)對急診患者細(xì)菌感染的早期診斷、合理使用抗菌藥物及療效評估提供血清學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對IL-6原核蛋白在大腸桿菌中表達(dá)及純化,為探索建立血清IL-6快速測定方法奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與菌株 pCzn1 質(zhì)粒、TOP10 克隆菌株及表達(dá)菌株Arctic-ExpressTM均由南京淘普生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI購自寶生物工程(大連)有限公司,Pfu DNA聚合酶購自南京淘普生物技術(shù)有限公司(貨號PC12)。胰蛋白胨、酵母粉購自英國OXOID公司,瓊脂糖購自上海基因公司。DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自美國AXYGEN公司。

1.2方法

1.2.1IL-6基因合成 根據(jù)基因庫IL-6蛋白的基因序列,由南京淘普生物技術(shù)有限公司采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設(shè)計(jì)全長拼接引物,在引物的兩端各設(shè)計(jì)了保護(hù)性堿基合成基因IL-6。

1.2.2重組質(zhì)粒pCzn1-IL-6構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別對合成基因PCR回收產(chǎn)物和pCzn1空載體進(jìn)行雙酶切 ,酶切后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化進(jìn)行連接反應(yīng),按10 μL反應(yīng)體系:10×連接緩沖液1 μL、pCzn1質(zhì)粒1μL、PCR產(chǎn)物4 μL、T4DNA連接酶1 μL,去離子水補(bǔ)充至10 μL。混勻后瞬時(shí)離心,置22 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化入TOP10 克隆菌株,使用含終濃度為50 mg/L氨芐西林的LB平板進(jìn)行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3質(zhì)粒酶切鑒定 以限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對重組質(zhì)粒進(jìn)行切割,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測pCzn1線性化載體和IL-6插入基因的大小。酶切體系：質(zhì)粒：3 μL,內(nèi)切酶1：0.25 μL,內(nèi)切酶2 ：0.25 μL,10×Buffer：1.0 μL,雙蒸水加至10μL。

1.2.4原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將pCZN1 -IL-6載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express ：將質(zhì)粒1 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)菌中,置冰上20 min；42 ℃熱激90 s,迅速置冰中5 min；加入600 μL LB培養(yǎng)液；37 ℃,220 r/min振搖1 h,離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。IPTG誘導(dǎo)pCZN1 -IL-6載體原核蛋白的表達(dá)：挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于3 mL LB培養(yǎng)液的試管中,37 ℃振搖過夜；次日按1∶100接種于30 mL LB培養(yǎng)液中,37 ℃ 振搖至菌體OD600為0.6～0.8；取出1 mL培養(yǎng)物離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37 ℃ 220 r/min振搖4 h,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1 mL培養(yǎng)物,室溫離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀,剩余培養(yǎng)物離心棄上清,用 PBS重懸菌體沉淀,重懸液進(jìn)行超聲波破碎后,分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測分析,考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

1.2.5原核蛋白的Ni柱親和純化及結(jié)果分析 上述誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液Ni柱純化：利用低壓層析系統(tǒng)按照其說明書進(jìn)行純化,對純化樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE及Western Blot鑒定。

2 結(jié) 果

2.1pCzn1-IL-6測序驗(yàn)證 重組質(zhì)粒pCzn1-IL-6化學(xué)法轉(zhuǎn)化入TOP10 克隆菌株,使用LB平板進(jìn)行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果與預(yù)期序列一致,證實(shí)插入基因序列正確,無突變、缺失,可以確定pCZN1 -IL-6原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對。見圖1。

圖1 部分序列比對結(jié)果圖

2.2質(zhì)粒酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,IL-6基因片段在500 bp稍上位置,與預(yù)期目的片段550 bp相符(圖2)。

注：Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500；基因名稱：IL-6(OD260/OD280:1.82)；酶切鑒定：NdeI - XhoI； M:Marker；Line1:酶切前質(zhì)粒；Line2: 酶切后質(zhì)粒圖2 質(zhì)粒酶切鑒定

2.3原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 pCZN1 -IL-6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express, 利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),培養(yǎng)物經(jīng)12% SDS-PAGE分析。誘導(dǎo)后在目的蛋白約24.15KD 區(qū)域有明顯的特異條帶,未誘導(dǎo)的菌株無特異的表達(dá)條帶,目標(biāo)蛋白主要存在于沉淀中,說明原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)成功。在誘導(dǎo)破碎后上清和沉淀中都有目的條帶,說明IL-6蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在于表達(dá)菌中,主要以包涵體形式存在。見圖3。

注：M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 1: 未誘導(dǎo)；2: 誘導(dǎo)后；3: 誘導(dǎo)破碎后上清；4: 誘導(dǎo)破碎后沉淀圖3 蛋白表達(dá)鑒定SDS-PAGE分析

2.4原核蛋白Ni柱純化及結(jié)果分析 包涵體經(jīng)過變復(fù)性的方式,重溶目標(biāo)蛋白,通過Ni柱親和純化獲得目標(biāo)蛋白,進(jìn)行12% SDS-PAGE分析,結(jié)果見圖4。

注：M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: 破碎后處理樣品；2: 流出；3: 洗脫圖4 蛋白純化SDS-PAGE分析

2.5Western Blot結(jié)果分析 取純化樣品5 μl經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,再經(jīng)一抗和二抗反應(yīng),最后ECL顯影,曝光。在14～25 KD之間有明顯的曝光條帶,目的蛋白為24.15 KD。Western Blot檢測結(jié)果結(jié)果見圖5。

注：M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1: 純化后樣品圖5 蛋白Western Blot鑒定分析

3 討 論

IL-6是細(xì)胞因子之一,具有多種生物活性,由多種組織細(xì)胞產(chǎn)生,可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)以及造血功能等,在眾多疾病中發(fā)揮著重要作用[5]。炎癥反應(yīng)發(fā)生后,IL-6率先生成,檢測血清中IL-6濃度可用來輔助急性感染的早期診斷。IL-6半衰期僅1h,在感染控制后其血清濃度下降更快、幅度更大,能更快地反映抗生素治療的效果。有研究報(bào)告IL-6還是急危重癥患者感染嚴(yán)重程度及病情預(yù)后評估的良好指標(biāo)[6-7]。研究表明,盡管單獨(dú)的IL-6血清學(xué)檢驗(yàn)有重要臨床價(jià)值,但其他非感染因素也可致IL-6升高[8],其與PCT、CRP及SAA等感染指標(biāo)聯(lián)合檢測對臨床評估患者并發(fā)細(xì)菌感染時(shí)具有更佳的評估效能,可彌補(bǔ)各個(gè)指標(biāo)單獨(dú)測定的不足,更有助于醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)感染[9-10],在鑒別診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后評估上更有價(jià)值[11-13]。目前,抗菌藥物臨床應(yīng)用管理日趨嚴(yán)格和規(guī)范化,由于細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)較長及用藥后也不適合做細(xì)菌培養(yǎng),故治療中判斷抗生素治療的效果主要靠感染指標(biāo)的血清學(xué)檢驗(yàn),對于敗血癥和膿毒血癥等重癥患者來講,快速檢測感染性血清學(xué)指標(biāo)就顯得尤為重要。目前國內(nèi)PCT、CRP和SAA單個(gè)項(xiàng)目的快速測定應(yīng)用已較為普遍,IL-6的快速測定應(yīng)用還不多見。我們試圖研制一種IL-6、PCT、CRP和SAA快速聯(lián)合檢測卡,生產(chǎn)IL-6純化蛋白用于抗體的制備是首要的任務(wù)。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得IL-6的包涵體蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中較為常用的一種,其優(yōu)點(diǎn)是遺傳背景比較清楚,表達(dá)水平較穩(wěn)定,操作相對容易,實(shí)驗(yàn)成本低,蛋白表達(dá)量高及容易純化等。本實(shí)驗(yàn)采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設(shè)計(jì)全長拼接引物,通過PCR得到了IL-6合成基因,并將其插入原核表達(dá)質(zhì)粒pCZN1,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pCZN1 -IL6。克隆菌株經(jīng)測序和載體的雙酶切證明構(gòu)建的表達(dá)載體正確。pCZN1 -IL6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express,參照文獻(xiàn)[14-15],利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),成功地在大腸桿菌Arctic Express中表達(dá)出IL-6蛋白。在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長,蛋白表達(dá)量逐漸上升,至第4 h時(shí)表達(dá)量最高。該重組蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,主要以包涵體形式存在,通過Ni柱親和純化獲得分子量24.15KD的目標(biāo)蛋白。

本研究成功合成IL-6融合蛋白,為下一步抗體制備等后續(xù)工作奠定了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。