血清miR-122和miR-199a對子宮內膜異位癥的診斷價值分析

王悅菲 蔡蓉 何琳△ 胡濤

(1.南京醫科大學附屬無錫第二人民醫院婦科,江蘇 無錫 214000；2.南京市婦幼保健院婦科,江蘇 南京 210000)

子宮內膜異位癥是一種慢性婦科疾病，是指有活性的內膜細胞種植在子宮內膜以外的位置而形成的一種女性常見婦科疾病[1]。5%～10%的育齡婦女存在子宮內膜異位癥，其中有80%的患者甚至影響到生育問題[2]。目前子宮內膜異位癥確診金標準是腹腔鏡，這是一種高度侵入性的操作，存在許多潛在的醫療風險[3]。因此在不影響病人治療的前提下要盡量避免腹腔鏡手術，就有必要尋找可靠的非侵入性診斷方法來診斷該疾病。miRNA有重要的靶基因[4]，其表達也影響子宮內膜異位癥等多種生理和病理狀態。正常子宮內膜組織和子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中幾種miRNA及其靶基因的表達存在差異[5]，而微陣列分析可以檢測這些miRNA在子宮內膜中的差異表達[6]。因此miRNA在子宮內膜異位癥患者中的差異表達，通過血清中循環miRNA的檢測可能具有較高的診斷價值[7]。子宮內膜異位癥婦女的炎癥標志物的測定還沒有明確的研究結論。除了miRNA水平，一些研究還證實患病婦女和健康婦女之間的血清白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)之間沒有差別，而有研究報告指出在子宮內膜異位癥婦女中IL-6水平較高[8]。子宮內膜異位癥的生物標志物如果能在血液或其他體液中檢測，如腹膜液、月經和子宮內膜液，將極大降低子宮內膜異位癥患者診斷的難度。本研究的目的是評價血清和腹膜液的miR-122、miR-199a和IL-6作為診斷子宮內膜異位癥的可靠無創生物標志物的效能。報告如下。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在我科住院的患者共計150例。納入標準：(1)所有盆腔子宮內膜異位癥，經腹腔鏡診斷并經組織病理學檢查證實的患者。(2)對照組的對象是因盆腔疼痛、不孕癥或良性腫瘤接受腹腔鏡手術但未被診斷為子宮內膜異位癥的婦女。排除標準:在腹腔鏡手術前3個月內因子宮腺肌病、子宮內膜癌、子宮內膜增生、子宮內膜息肉、慢性或急性炎癥疾病、傳染病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病等接受過藥物治療的患者。

1.2方法

1.2.1所有參與者都接受了完整的檢查，包括月經模式的評估、全身和腹部檢查、局部盆腔檢查以及腹腔鏡檢查子宮內膜異位癥的存在與否。

1.2.2手術前，在卵泡期(5～10 d)采集血液樣本：樣本在37 ℃下孵育15 min，離心15 min分離血清，-80 ℃保存。測定白細胞介素-6、miR-122和miR-199a水平，在腹腔鏡檢查時抽取腹腔積液：離心20 min取腹腔液中的細胞成分，在-80 ℃下保存上清液，測定IL-6、miR-122和miR-199 a水平，通過酶聯免疫吸附測定白細胞介素-6的濃度。

1.2.3RNA的提取是使用mirVana Paris Kit進行，含RNA的洗脫液在-20 ℃保存。

1.2.4通過聚合酶鏈反應(PCR)分析，定量實時檢測miR-122和miR-199 a的表達。以U6 RNA為內源對照，在42 ℃下處理20 μL RNA 1 h，在93 ℃下處理3 min，再用miRNasy血清反轉錄試劑盒進行反轉錄。逆轉錄產物(cDNA)保存在4 ℃。

1.2.5在PCR中，10 μL稀釋cDNA，12.5 μL SYBR原料，0.5 μM每個特異引物和超純水，總體積為25 μL。采用7800實時聚合酶鏈反應系統進行實時PCR反應，其熱循環參數為：95 ℃，10 s；57 ℃，30 s；75 ℃，30 s35個循環之后，再95 ℃，5 min。

1.2.6用循環閾值(CT)法定量miRNA的表達水平，CT定義為熒光信號跨過檢測閾值所需的周期數。從所研究的miRNA的CT值中減去U6RNA的CT值，計算參考樣品和靶標本的CT值。然后使用得到的標準化ΔCT值WER計算2-ΔCT的相對表達值。

1.3統計學方法 用SPSS軟件16.0進行統計分析。各組間比較采用χ2檢驗，t檢驗和方差分析。進行Pearson相關分析，以檢驗變量之間的相關性。ROC曲線分析，檢測血清和腹腔液miR-122和miR-199a的最佳臨界值。計算曲線下面積(AUC)以評價診斷試驗的準確性，AUC為0.90～1.00為優，0.80～0.90為良，0.70～0.80為一般，0.80～0.60為不合格，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1一般資料的比較 本研究包括80例盆腔子宮內膜異位癥(8例合并深浸潤性疾病)和70例無子宮內膜異位癥的婦女。兩組在年齡、體重指數、盆腔疼痛、痛經或月經異常方面差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 研究組的臨床特征[n(%)]

2.2實驗組和對照組比較 子宮內膜異位癥患者血清和腹腔液中IL-6、miR-122和miR-199 a水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 研究組血清和腹腔液IL-6、miR-122和miR-199 a的水平

不同時期子宮內膜異位癥患者血清和腹腔液中miR-122和miR-199 a水平差異無統計學意義，提示miR-122和miR-199 a水平與子宮內膜異位癥分期無關。見表3。

表3 標記物與子宮內膜異位癥分期的關系

血清miR-122和miR-199a檢測子宮內膜異位癥的敏感性分別為96.6%和100.0%，特異性分別為94.4%和100%。血清miR-122與IL-6(血清和腹膜液)、miR-199 a(血清和腹膜液)呈正相關，所有相關性差異有統計學意義(P<0.001)。血清miR-199 a與IL-6(血清和腹腔液)、miR-122(腹腔液)差異有統計學意義(P<0.001)。見表4。

表4 血清miR-122和血清miR-199 a與其他標記物的相關性

ROC曲線(圖1)分析顯示血清miR-122和miR-199a對子宮內膜異位癥有較高的診斷價值(表5)。

圖1 miR-122(左)和miR-199a(右)的特異性及敏感性分析

表5 血清miR-122和miR-199 a的ROC曲線分析

3 討 論

目前，子宮內膜異位癥主要由腹腔鏡診斷和評估[9]。因此在疾病的早期階段，由于缺乏癥狀和敏感的生物標志物，其檢測和治療往往被延誤[10]。在本研究中，子宮內膜異位癥患者血清和腹膜中miR-122、miR-199 a和IL-6水平明顯高于對照組，提示這些分子可作為診斷子宮內膜異位癥的生物標志物。國內有研究表明90%的婦女有月經逆行，但并非所有的婦女都有子宮內膜異位癥[11]。這一事實表明子宮內膜異位癥患者的子宮內膜在分子水平上的表達可能存在差異。這些分子差異可能會導致部分婦女患上子宮內膜異位癥[12]。如果這些差異確實是子宮內膜異位癥的病理改變，則參與分子可能成為腹腔鏡組織活檢的重要生物標志物。

miRNA在多種生理和病理條件下起著至關重要的作用[13]。血漿miRNA譜改變已檢測到存在于各種類型的癌癥，包括實體腫瘤，白血病，B細胞淋巴瘤，卵巢癌，以及糖尿病和肝硬化[14,15]。由于血清標志物檢測方法簡單、便于測量，檢測血清特異性循環miRNA水平的變化有助于子宮內膜異位癥的診斷。事實上許多miRNA被認為在子宮內膜異位癥中起著一定的作用[16]。且miRNA作為檢測子宮內膜異位癥的生物標志物是一個相對較新的研究領域，目前研究血清或血漿miRNA預測值的研究還很少[17]。

綜上所述，本研究顯示與對照組相比子宮內膜異位癥患者血清、腹膜液中的miR-122和miR-199a水平顯著升高。因此，這些miRNA在子宮內膜異位癥的診斷中具有作為生物標志物的潛力。疾病早期非侵入性檢測這些標記物，成本和對患者的創傷遠遠低于現有的方法。而目前已證實這些標記物在的血清水平與腹膜水平相比具有相關性，最終可以避免通過腹腔鏡手術抽取腹腔液。除本研究外，還可以進一步研究血清中其他的miRNA，進而找到更為合適的分子標記物，明確相關分子標記物診斷子宮內膜異位癥的金標準。