IFN-α調控miR-214-5p/MFGE8通路對人腦血管外膜成纖維細胞增殖、凋亡的影響

郭延兵 姚慶和 王新軍

血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)是細胞外膜的重要細胞組分之一，其增殖和凋亡之間的失衡導致新生內膜形成和病理性血管重構，在高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增生性疾病的病理結局中起決定性作用[1]。干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗菌、影響細胞增殖、凋亡以及分化、調節免疫功能等多種生物活性的細胞因子家族。近年來研究顯示，IFN-α通過調控基因表達在血管增生性疾病中發揮重要作用[2]。miR-214-5p是一類與心血管疾病密切相關的微小RNA(microRNA，miRNA)，研究顯示冠心病患者血漿中miR-214-5p表達失調與冠狀動脈側支循環形成顯著相關[3]。miR-214-5p介導運動對心臟的保護作用，是心血管運動康復和其他干預措施的靶點[4]。

乳脂肪球表皮生長因子8(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFGE8)是一種分泌性糖蛋白，其可整合細胞內信號清除死亡細胞，介導血管細胞和胞外基質在應激下的不良反應，參與血管衰老和血管重構[5]。生物信息學分析顯示MFGE8是miR-214-5p的潛在靶基因，但IFN-α能否調控miR-214-5p/MFGE8通路進而影響VAFs的增殖和凋亡尚未見文獻報道。因此，本研究擬通過觀察IFN-α對miR-214-5p和MFGE8表達以及人腦血管外膜成纖維細胞(human cerebral vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影響，揭示其作用機制，以期為IFN-α、miR-214-5p/MFGE8通路在治療血管增生性疾病中的應用奠定理論基礎。

材料與方法

1.材料與試劑:HBVAFs細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；干擾素購自北京三元基因藥業股份有限公司；miRNA抑制物對照(anti-miR-con)、miR-214-5p抑制物(anti-miR-214-5p)、空載體(pcDNA)、MFGE8過表達載體(pcDNA-MFGE8)、小干擾RNA對照(si-con)、MFGE8小干擾RNA(si-MFGE8)、野生型熒光素酶報告基因載體(WT-MFGE8)、突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-MFGE8)以及PCR引物由上海生工生物工程公司提供；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自美國Sigma公司；膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗體、兔源B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)抗體和兔源Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體購自美國CST公司；兔源MFGE8抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體和山羊抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.細胞分組和處理：復蘇細胞后，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、濕度80%、含5% CO2的細胞培養箱中培養，當細胞密度80%時進行傳代培養。將P3代生長良好的HBVAFs細胞分為8組，正常培養的HBVAFs細胞為NC組；用終濃度為2000U/ml的IFN-α處理HBVAFs細胞24h標記為IFN-α組[2]；將anti-miR-con、anti-miR-214-5p、pcDNA、pcDNA-MFGE8分別轉染HBVAFs細胞后，用2000U/ml的IFN-α處理細胞24h依次標記為IFN-α+anti-miR-con組、IFN-α+anti-miR-214-5p組、IFN-α+pcDNA組、IFN-α+pcDNA-MFGE8組；將anti-miR-214-5p分別與si-con、si-MFGE8共轉染至HBVAFs細胞后，用2000U/ml的IFN-α處理細胞24h，依次標記為IFN-α+anti-miR-214-5p+si-con組和IFN-α+anti-miR-214-5p+si-MFGE8組。

3.qRT-PCR檢測miR-214-5p和MFGE8 mRNA的表達水平：以TRIzol法提取各組HBVAFs細胞的總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板參照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。其中miR-214-5p上游引物序列為5′-TCTCTTGCTATAGAAGCACAAC-3′，下游引物序列為5′-TCCTCCACAATCATGCTGTGT-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′；MFGE8上游引物序列為5′-GTGCGTGTGACCTTCTTG-3′，下游引物序列為5′-ACCTGTTACCCACATCCT-3′；β-actin上游引物序列為5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物序列為5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。分別以U6和β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-214-5p和MFGE8 mRNA的相對表達水平。

4.MTT法檢測細胞活力：胰蛋白酶消化處理HBVAFs細胞并接種于96孔板，按照上述方法進行相應處理。終止培養前4h向每孔內加入20μl質量分數為5mg/L的MTT。棄去培養基后，加入150μl的DMSO室溫震蕩10min，全自動酶標儀檢測490nm波長處的吸光度。

5.流式細胞術檢測細胞凋亡:收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞后，加入適量的結合緩沖液調整細胞濃度為1×106/ml。取100μl細胞懸液加入到流式管，按照annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒分別加入5μl的annexin V-FITC和5μl的PI，混勻后室溫避光孵育15min，補加400μl的結合緩沖液后，立即上機檢測細胞凋亡情況。

6.Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達：收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，參照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度和純度。取適量的細胞蛋白，加入等體積的2×上樣緩沖液充分混勻后，置于沸水浴中變性5min。取30μg已變性的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后，采用轉膜裝置將已分離的細胞蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，接著采用5%脫脂牛奶的封閉液室溫條件封閉1h。將Ⅰ抗按照相應的比例稀釋后，室溫孵育膜1h，采用TBST洗膜10min，洗3次后，用已稀釋的Ⅱ抗室溫孵育膜1h，TBST漂洗膜3次后，加入化學發光試劑進行顯色，隨后于凝膠成像系統進行曝光和拍照分析。

7.雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-214-5p和MFGE8的靶向關系：生物信息學軟件targetscan預測顯示miR-214-5p與MFGE8的3′-UTR區域存在部分連續互補的核苷酸序列，推測MFGE8是miR-214-5p的靶基因并利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證二者的靶向關系。將含MFGE8的3′-UTR的野生型熒光素酶報告基因載體WT-MFGE8與突變型熒光素酶報告基因載體MUT-MFGE8分別與miR-214-5p 模擬物、miR-con共轉染至HBVAFs細胞，轉染6h后更換細胞培養液，轉染48h檢測各組細胞的熒光素酶活性。為證實miR-214-5p對MFGE8的調控關系，分別將miR-con、miR-214-5p、anti-miR-con、anti-miR-214-5p轉染至HBVAFs細胞，轉染48h檢測采用Western blot法檢測MFGE8蛋白表達水平變化。

結 果

1.IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞miR-214-5p和MFGE8表達的影響:與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細胞中miR-214-5p的表達水平(6.43±0.77 vs 1.00±0.12)顯著升高，MFGE8 mRNA(0.41±0.05 vs 0.86±0.09)和MFGE8蛋白(0.29±0.04 vs 0.65±0.07)的表達水平顯著降低(P<0.05，圖1)。

圖1 Western blot法檢測人腦血管外膜成纖維細胞MFGE8表達

2.干擾miR-214-5p促進IFN-α誘導人腦血管外膜成纖維細胞增殖：與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細胞miR-214-5p的表達水平顯著升高，細胞活力顯著降低；與IFN-α+anti-miR-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細胞miR-214-5p的表達水平顯著降低，細胞活力顯著增加(P<0.05)，詳見表1。

3.干擾miR-214-5p抑制IFN-α誘導人腦血管外膜成纖維細胞凋亡:與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著增加；與IFN-α+anti-miR-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),詳見表2、圖2。

表1 MTT檢測人腦血管外膜成纖維細胞活力

與NC組比較，*P<0.05；與IFN-α+anti-miR-con組比較，#P<0.05

表2 干擾miR-214-5p抑制IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞凋亡和影響Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

與NC組比較，*P<0.05；與IFN-α+anti-miR-con組比較，#P<0.05

圖3 miR-214-5p與MFGE8存在靶向序列并調控其蛋白表達A.miR-214-5p與MFGE8存在連續互補核苷酸序列；B.Western blot法檢測蛋白表達

4.miR-214-5p靶向調控MFGE8表達:通過targetscan網站在線預測顯示，miR-214-5p與MFGE8的3′-UTR區域存在部分連續互補的核苷酸序列(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-con和WT-MFGE8共轉染組比較，miR-214-5p 模擬物和WT-MFGE8共轉染組人腦血管外膜成纖維細胞的熒光素酶活性(0.67±0.09 vs 1.00±0.08)顯著降低(P<0.05)；與miR-con和MUT-MFGE8共轉染組比較，miR-214-5p 模擬物和MUT-MFGE8共轉染組人腦血管外膜成纖維細胞的熒光素酶活性變化比較(1.07±0.12 vs 1.11±0.16)，差異無統計學意義(P>0.05)。與miR-con組比較，miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細胞MFGE8蛋白的表達水平(0.26±0.03 vs 0.58±0.06)顯著降低；與anti-miR-con組比較，anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細胞MFGE8蛋白的表達水平(0.89±0.09 vs 0.51±0.05)顯著升高(P<0.05,圖3B)。

5.過表達MFGE8促進IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞增殖抑制細胞凋亡：與IFN-α+pcDNA組比較，IFN-α+pcDNA-MFGE8組人腦血管外膜成纖維細胞MFGE8蛋白的表達水平顯著升高，細胞活力顯著增加，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),詳見表3和圖4。

表3 過表達MFGE8促進IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞增殖抑制細胞凋亡

與IFN-α+pcDNA組比較，*P<0.05

圖4 流式細胞術檢測細胞凋亡和Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達A.流式細胞術檢測細胞凋亡；B.Western blot法檢測蛋白表達

6.干擾MFGE8部分反轉anti-miR-214-5p對IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞增殖和凋亡的作用:與IFN-α+anti-miR-con+si-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p+si- MFGE8組人腦血管外膜成纖維細胞MFGE8蛋白的表達水平顯著降低，細胞活力顯著降低，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達水平顯著增加，Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05),詳見表4和圖5。

討 論

近年來，隨著對血管增生性疾病研究的不斷深入，發現血管外膜成纖維細胞的激活、過度增殖、細胞表型轉化是血管增生性疾病進展的關鍵環節[1]。如何有效地抑制血管外膜成纖維細胞增殖，促進其凋亡對防治血管增生性疾病具有重大意義。

表4 干擾MFGE8和anti-miR-214-5p對IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞增殖和凋亡的影響

與IFN-α+anti-miR-con+si-con組比較，*P<0.05

圖5 流式細胞術檢測細胞凋亡和Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達A.流式細胞術檢測細胞凋亡；B.Western blot法檢測蛋白表達

IFN被廣泛認為是先天免疫應答的一個組成部分，自1957年首次發現干擾素以來，目前已有多種干擾素相繼被發現，根據不同受體主要將IFN分為Ⅰ型(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ)、Ⅱ型(IFN-γ)和Ⅲ型(IFN-λ)3種亞型[6]。研究發現，IFN-α通過誘導干擾素誘導蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)和P21蛋白表達上調，降低血管內皮細胞活力，誘導細胞凋亡[7，8]。IFN-α還可抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖和誘導其凋亡[9,10]。此外，IFN-α還可抑制血管外膜成纖維細胞的增殖與遷移，促進其凋亡[11]。本研究發現IFN-α可顯著降低血管外膜成纖維細胞活力，降低促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax的表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡,與上述研究結論一致，提示采用IFN-α治療血管增生性疾病具有一定的可行性。

長期起來對miR-214-5p的研究多集中在腫瘤方面，已在骨肉瘤、肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中發現miR-214-5p的抗腫瘤作用[12～14]。近年來miR-214-5p在心血管疾病中的作用才逐漸被揭示。研究顯示，miR-214-5p水平的降低與胎盤生長因子水平的升高和動脈粥樣硬化的惡化有關，miR-214-5p是重度冠狀動脈疾病潛在的保護劑和生物學標志物[15]。miR-214-5p通過靶向NCK相關蛋白1(NCK association protein 1，NCKAP1)在一定程度上抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，防止血管損傷后新生內膜平滑肌細胞增生[16]。然而，另一項研究則表明抑制miR-214-5p表達對心肌肥大和心理衰竭具有治療作用[17]。本研究顯示IFN-α干預處理促進血管外膜成纖維細胞miR-214-5p表達，干擾miR-214-5p表達則反轉IFN-α對血管外膜成纖維細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。提示IFN-α抗血管外膜成纖維細胞作用與上調miR-214-5p表達有關。

MFGE8與人類疾病進展密切相關，研究顯示MFGE8表達增加，個體表現出更高的冠狀動脈疾病風險，抑制MFGE8表達可抑制冠狀動脈平滑肌細胞增殖，具有抗動脈粥樣硬化作用[18]。在黑色素瘤中，間充質基質細胞產生大量的MFGE8，MFGE8促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和內皮素1(endothelin 1，ET-1)表達，導致血管生成和腫瘤生長增強。此外，糖基化低密度脂蛋白通過下調MFGE8誘導大鼠視網膜微血管內皮細胞凋亡，改善MFGE8表達對糖尿病視網膜病變具有保護作用[19]。本研究顯示，IFN-α干預處理顯著抑制血管外膜成纖維細胞MFGE8表達，并通過雙熒光素酶報告基因實驗Western blot法檢測證實miR-214-5p靶向負調控MFGE8表達，過表達MFGE8則反轉IFN-α對血管外膜成纖維細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。進一步研究顯示，干擾MFGE8表達反轉抑制miR-214-5p表達對IFN-α誘導的人腦血管外膜成纖維細胞增殖和凋亡的作用。以上研究說明IFN-α對人腦血管外膜成纖維細胞增殖抑制和凋亡促進作用與調控miR-214-5p/MFGE8通路有關。

綜上所述，IFN-α通過調控miR-214-5p/MFGE8通路抑制人腦血管外膜成纖維細胞增殖，促進細胞凋亡。本研究為IFN-α在血管增生性疾病治療中的應用奠定理論基礎，miR-214-5p/MFGE8有望成為血管增生性疾病的潛在治療靶點。