P16和P15在惡性黑色素瘤中的表達及其臨床意義

陳銓栩 陳灣灣 張 普 羅曉智 趙志光

惡性黑色瘤(malignant melanoma，MM)是起源于表皮黑素細胞的高度惡性腫瘤，其轉移性強、發展迅速、預后差及病死率高[1]。近年來世界范圍內的黑色素瘤的發生率呈逐年增加的趨勢，發病年齡也逐漸年輕化，相應的病死率也隨之增加[2,3]。MM發病機制目前尚不明確，大多數MM存在BRAF基因突變，BRAF基因突變與MM發生、發展和預后密切相關[4]。另有研究顯示，大部分的痣長到3～5mm會進入生長停滯，只有一小部分色素痣有重新獲得增殖并形成黑色素瘤的能力[5]。而原癌基因誘導的停滯與由CDKN2A和CDKN2B基因編碼的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P16和P15的表達相關。

本研究應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase, SP法)免疫組化檢測66例MM組織中P16、P15的表達情況，并進行相關因素分析和預后分析，探討P16、P15在MM中的臨床意義。

材料與方法

1.標本來源：收集溫州醫科大學附屬第二醫院2013年1月～2018 年1月經病理科確診為惡性黑色素瘤的患者。納入及排除標準為：(1)患者病理診斷明確，相關MM免疫組化指標支持，排除可疑性病理診斷及混合其他惡性成分的病理診斷。(2)患者腫瘤均行手術根治，術前未行抗腫瘤治療。(3)患者臨床資料完整，預后分析時排除隨訪時間不足1年失訪的患者。共納入66例MM的組織標本作為實驗組，另設60例同一時期診斷為皮內痣的組織標本作為對照組。

2.研究方法：將所有標本選取病變區域制成組織芯片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)進行免疫組化。大致過程為：切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟水化，3%H2O2酶(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，檸檬酸修復液微波加熱修復10min并冷卻至室溫，非免疫血清(北京中杉金橋公司)室溫封閉3h，鼠抗人P16、P15抗體(英國Abcam公司)按1∶200稀釋后4℃冰箱孵育過夜，二抗(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，DAB試劑(北京中杉金橋公司)顯色，蘇木精中核復染，梯度乙醇及二甲苯中脫水，中性樹膠封片。統計患者的臨床及病理資料，包括性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、Ki-67增殖指數和BRAF V600E基因突變情況等。主要通過電話以及住院觀察隨訪，截止時間至2019年6月，生存期以月為單位。

3.免疫組化結果判定：P16、P15陽性表現為黃色顆粒，主要定位于細胞核，部分細胞質也有少量表達。由兩位病理科醫生進行雙盲閱片，隨機觀察5個高倍視野(×400)進行結果判定：(1)陽性細胞占總細胞數的比率評分：0～10%為0分，10%(不含)～25%為1分，25%(不含)～50%為2分，>50%為3分。(2)著色深度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分。依據陽性細胞占總細胞數的比率×著色深度得出總分進行判定：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

4.統計學方法：采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料采用卡方檢驗；預后分析采用Kaplan-Meier曲線，生存率比較采用Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.P16、P15在惡性黑色瘤與皮內痣組織中的表達情況：P16在惡性黑色瘤和皮內痣組織的陽性表達率分別為30.3%和81.7%；P15在MM和皮內痣組織的陽性表達率分別為22.7%和86.7%。MM中的P16(χ2=33.470,P=0.000)和P15(χ2=51.603,P=0.000)陽性表達率均明顯低于皮內痣，詳見圖1、表1。

圖1 P16、P15在MM與皮內痣組織中的表達(SP法，×200)A、B.MM組織中P15、P16的表達；C、D.皮內痣組織中P15、P16的表達。箭頭所指為細胞核及細胞質染色。根據免疫組化結果判定：A(-)、B(-)、C(+)、D(-)

表1 P16、P15在MM與皮內痣組織中的表達(n)

2.P16、P15在MM中的表達與臨床特征的關系：MM組織中P16的陽性表達水平與腫瘤浸潤深度(χ2=17.888,P=0.000)、淋巴結轉移(χ2=5.561,P=0.018)和Ki-67增殖指數(χ2=7.108,P=0.008)呈負相關，而與性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑、遠處轉移和BRAF V600E基因突變無關(P均>0.05)。P15的陽性表達水平與腫瘤浸潤深度(χ2=9.156,P=0.000)、淋巴結轉移(χ2=8.817,P=0.003)、遠處轉移(χ2=4.970,P=0.026)和Ki-67增殖指數(χ2=15.422,P=0.000)呈負相關，而與性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑和BRAF V600E基因突變無關(P均>0.05)，詳見表2。

3.MM中P16與P15表達水平的相關性：MM中P16與P15表達水平呈高度正相關(r=0.744)，詳見表3。

表2 P16、P15在MM中的表達與臨床特征的關系(n)

*BRAF基因檢測時有4例組織因標本量太少無法檢測

表3 MM中P16與P15表達水平的相關性(n)

4.P16、P15在MM中的表達與預后的關系：66例MM患者中，有3例患者在后期隨訪過程中失訪，最后共納入63例患者進行預后分析；其中58例死亡，5例隨訪截止時仍存活。患者總體中位生存期為22.3個月，95% CI為13.523～31.077，1年、2年和3年生存率分別為82.5%、42.9%和21.9%。P16表達陰性的患者，中位總體生存期明顯短于表達陽性的患者(14.0個月 vs 28.6個月)，差異有統計學意義(χ2=5.033,P=0.025)。P15表達陰性的患者，中位總體生存期明顯短于表達陽性的患者(14.0個月 vs 33.4個月)，差異有統計學意義(χ2=8.949,P=0.003)，詳見圖2。

討 論

惡性黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一，大多數具有很強的侵襲性，較早發生轉移，預后極差。雖然我國發生率相對較低，但近年來發生率呈快速增長趨勢，已成為嚴重威脅生命健康的惡性疾病之一[6]。

圖2 P16、P15在MM中的表達與預后的關系A.MM患者總體生存期曲線；B.不同P16表達水平的MM患者總體生存期曲線；C.不同P15表達水平的MM患者總體生存期曲線

P16基因位于染色體9p21上，是發現的第一個直接參與細胞周期調控的腫瘤抑制基因，與腫瘤的發生、發展過程密切相關[7]。其表達產物P16INK4A可與CNK4和CNK6特異性結合，阻礙其與細胞蛋白D1形成復合物，使RB磷酸化受阻，使細胞停留在G1期，無法進入S期，抑制腫瘤的增殖[8,9]。P15是CKI中INK4家族成員之一，它通過抑制CyclinD-CDK,將細胞阻斷在G1期[10]。當P16、P15基因突變或失活時，P16、P15表達下調，細胞周期無法調控，以致細胞無限生長從而發生腫瘤。臨床上，大多數痣長到3～5mm通常會退出增生期進入生長停滯狀態。雖然大多數痣仍處于生長停滯狀態(甚至在高齡時段消退)，但有一小部分痣存在重新獲得增殖并形成黑色素瘤的能力[11]。癌基因誘導的停滯是由細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN2A編碼的P16和CDKN2B編碼的P15高表達促進的[12]。本研究結果顯示，P16和P15在MM中表達均下調，可能對鑒別MM和良性黑素細胞病變具有診斷價值。雖然MM中P16和P15的表達呈高度正相關，但相比較而言，P15的表達下調更顯著，可能成為診斷MM更可靠的生物學標志物之一，這也與Ma等[13]的研究結果一致。

MM的分期與腫瘤的直徑、浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移相關。P16、P15的表達水平與腫瘤的直徑并無明顯相關性，可能的原因是本研究應用的組織芯片只包括部分腫瘤組織，對于較大的腫瘤有一定局限性。隨著病變浸潤深度的增加和淋巴結轉移，P16、P15的表達逐漸下降，表明兩者可能與MM的侵襲與淋巴結轉移能力相關，可能的機制是P16、P15基因突變或失活時，細胞周期失去抑制，導致細胞無限生長以致腫瘤侵襲性和轉移性增強。Su等[14]研究也顯示，在結膜惡性黑色素瘤中P16的表達水平與腫瘤的侵襲能力呈負相關。同時，P15的表達與MM發生遠處轉移呈負相關，表明在預測MM發生遠處轉移方面，P15更有優勢。另外，表面有無破損也是腫瘤分期的指標之一，然而大部分患者數據缺失，因此并無納入本研究。Ki-67 是一種細胞增殖相關的核抗原，可以反映腫瘤的增殖、浸潤、轉移和預后等。本研究以10%為臨界點，得出P16、P15的表達與Ki-67增殖指數呈負相關；P16、P15表達缺失，腫瘤細胞增殖更活躍，可能通過多種機制增強腫瘤的侵襲能力。BRAF基因突變是MM最常見的突變方式，主要是BRAF V600E突變，平均突變率為60%～80%，與MM發生、發展和預后密切相關。Mackiewicz-Wysocka等[7]研究顯示，色素痣P16的表達水平在BRAF突變型中更高，惡性黑色素瘤P16的表達水平在BRAF突變型中更低。而本研究顯示，P16的表達水平與BRAF基因無明顯相關性，可能的原因是痣細胞增殖被BRAFV600E瞬時激活，BRAFV600E也誘導P16表達來停止黑素細胞增殖[15]。

國內外關于P16、P15與預后的關系，爭議很大。本研究顯示，P16與P15的表達水平均與MM的總體生存期呈正相關。P16與P15的表達水平下調，腫瘤細胞增殖更活躍，侵襲能力與轉移能力更強，因而患者的預后不佳。吳曉雯等[16]研究也顯示，P16 INK4A 基因突變會阻礙與CNK4和CNK6特異性結合，從而腫瘤增殖更活躍，生存期更短。但是，Chen等[17]研究顯示，P16高表達預示黏膜黑色素瘤有較差的生存期；Sanki等[18]研究顯示，P16的表達與皮膚黑色素瘤的生存期無關。這種爭議，可能與納入的患者的分期以及治療不同有關，有待于增加樣本量進一步研究。

本研究收集了筆者醫院近5年的MM患者66例，樣本量仍偏少；隨訪過程中，有3例(4.5%)患者失訪；隨訪截止時，有5例(7.9%)患者仍存活，這對研究結果產生一定的誤差。因此，筆者還會進一步納入相關患者，延長隨訪時間，以得到更為可靠的結果[19]。

綜上所述，P16、P15可能在惡性黑色素瘤的發生和發展中起負性作用，可以作為鑒別MM和良性黑素細胞病變的指標，也可能對MM患者的預后具有一定的指導意義。