MiR-130b在膠質瘤中的表達及對血管生長的影響

張 靜 周永剛 舒俊斌 李曉波 呂曉俊 葉汝勇 李正在

新生血管的生成在實體瘤的發展和遠處轉移過程中發揮著舉足輕重的作用，實體瘤生長至2mm3左右就必須要新生血管長入才能繼續維持腫瘤血供，血管內皮細胞在腫瘤組織內增殖并相互連接形成新生血管，為腫瘤細胞惡性增殖所必須的氧氣及營養成分提供血運通路，同時為腫瘤轉移提供了準備條件。膠質瘤作為中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，具有極強的侵襲性，當前膠質瘤患者的治療存在高復發率和高病死率這兩大難題，預后較差，同時膠質瘤作為一種血供較為豐富的腫瘤，其血管新生異常旺盛[1, 2]。因此，探討膠質瘤血管新生的分子作用機制和潛在的遺傳異常是當前亟待解決的問題。

既往研究發現，miRNA作為基因組中的非編碼序列，可通過與靶基因的3′-UTR的配對從而降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，進而在機體發育、分化和代謝等多個生物學過程中發揮關鍵調控作用[3,4]。當前研究表明，miR-130b在肺癌和甲狀腺癌等多種實體腫瘤中表達下調[5,6]。同時miR-130b與胰腺癌轉移密切相關[7]。在結腸癌細胞中特異性上調miR-130b的表達可抑制腫瘤細胞血管生長[8]。以上研究表明miR-130b與惡性腫瘤多種惡性生物學行為密切相關，而miR-130b在膠質瘤細胞中的表達和惡性生物學行為的關系尚未有研究報道。因此，本研究將探討miR-130b在膠質瘤血管新生中的作用及具體作用機制，為膠質瘤的防治研究提供有益參考。

材料與方法

1.細胞與試劑:膠質瘤細胞株U251、SHG-44和U87及人正常星形膠質細胞系NHA購自上海細胞生物研究所；DMEM高糖培養基和胎牛血清購自杭州四季青公司；EGM-2培養基購自美國Invitrogen公司；含EDTA胰蛋白酶購自中國吉諾公司；LipofectamineTM2000購自美國Life Technologies公司；miR-130b及內參U6引物和探針由廣州銳博生物公司設計合成；RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自美國ABI 公司；miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其陰性對照模擬物NC和抑制劑NC均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；VEGFA酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液購自北京中山生物工程公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；EMSA試劑盒購自美國Pierce公司；TNF-α和VEGFA抗體購自美國Epitomics公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

2.細胞培養：U251、SHG-44、U87和NHA細胞均培養于DMEM培養基中，HUVECs培養于EGM-2培養基中，所有培養基中均添加10%的胎牛血清，細胞均置于37℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養箱中，當細胞貼壁鋪滿80%～90%視野時，使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

3.細胞分組及轉染：收集對數生長期膠質瘤細胞，用完全培養基制成單細胞懸液并調整濃度為5×106/ml，將細胞懸液接種至6孔板中，每孔100μl，每組設3個復孔，待細胞融合至70%～80%時進行細胞轉染。根據LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進行操作，實驗分為以下4組：①模擬物NC組：每孔U87細胞加入100nmol的模擬物NC及5μl 轉染試劑；②miR-130b模擬物組：每孔U87細胞加入100nmol的miR-130b模擬物及5μl轉染試劑；③抑制劑NC組：每孔U251細胞加入100nmol的抑制劑NC及5μl 轉染試劑；④miR-130b抑制劑組：每孔U251細胞加入100nmol的miR-130b抑制劑及5μl 轉染試劑，轉染后48h收集細胞行PCR檢測，確定轉染效率后再進行細胞體外實驗。

4.qRT-PCR檢測miR-130b 的表達：在轉染后的膠質瘤細胞中用Trizol試劑提取細胞總RNA，RNA濃度由超微量分光光度計檢測，反轉錄和熒光定量PCR過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，設置U6作為內參，通過2-△△Ct法計算miR-130b的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

5.收集膠質瘤細胞條件培養基(CM)：將膠質瘤細胞接種于75cm2培養瓶中，加入適量完全培養基，待細胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養基，用PBS緩沖液反復沖洗4次，再加入不含血清的DMEM培養基20ml，放置細胞培養箱孵育12h后收集上清液，以2500r/min速度下常溫離心5min，將上清液用0.22μm過濾器過濾后，保存于4℃冰箱中。

6.ELISA法檢測CM中VEGFA含量:取出冷藏的CM，按照VEGFA酶聯免疫吸附檢測試劑盒說明書進行操作，設立標準品濃度，在ELX808U酶標儀(美國Bio-Tek公司)上自動擬合標準曲線，檢測各孔吸光度(A)值，計算出樣本CM中VEGFA的含量。

7.Transwell小室侵襲實驗:將Matrigel基底膠使用無血清DMEM培養基稀釋7倍，將稀釋好的基底膠均勻鋪被到Transwell上室底部，然后放置于細胞培養箱中培養0.5h以促進Matrigel凝固。待Matrigel膠完全凝固后，小心取出上室并吸去殘余液體，再加入50μl無血清DMEM培養基，然后再放置于細胞培養箱中繼續孵育0.5h。將20μl細胞懸液加入Transwell上室中，同時在Transwell下室中添加500μl含20%胎牛血清的細胞培養基，然后將Transwell小室放置于細胞培養箱中繼續孵育24h，實驗重復3次，每組設5個復孔。將放置培養箱中孵育24h的Transwell小室取出，去除上室及下室中的培養基，用棉棒小心擦去小室底膜上的細胞，并用無菌PBS液小心清洗2遍。將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20min，用PBS液清洗3遍后再用結晶紫溶液染色15min。將Transwell上室自結晶紫溶液中取出后，使用PBS溶液清洗3遍，將Transwell上室置于載物片上，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，在高倍鏡下隨機選擇10個視野拍照并采集圖像。

8.小管形成實驗:將HUVECs接種于6孔培養瓶中，加入含20% FBS的EGM-2培養基，待細胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養基，用PBS緩沖液反復沖洗2次，加入CM培養24h。實驗組設置為不同組別CM培養的HUVECs，對照組設置為含1% FBS的EGM-2培養基培養的HUVECs。將不含胎牛血清的培養基和Matrigel膠放置4℃冰箱過夜預冷，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養基和Matrigel膠，將250μl稀釋后的Matrigel膠加入24孔板中，再放入細胞培養箱中孵育1h，至Matrigel膠凝固。調整HUVECs濃度為2×105/L，將0.1ml細胞懸液接種于預先鋪好基質膠的24孔板中，再放置細胞培養箱中孵育過夜，最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況。

9.熒光素酶報告基因檢測:將重組熒光素酶報告載體mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR或wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR共轉染入U87細胞中，再分別將miRNA-130b抑制劑或抑制劑NC轉染至U87細胞中，轉染48h后收獲細胞，按熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書提供的方法對樣品熒光素酶活性進行檢測，每組樣本設5個復孔，熒光素酶相對活性=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

10.EMSA檢測NF-κB活性:按照EMSA試劑盒的說明書進行檢測，使用細胞裂解液處理細胞后，再使用BSA法對各組細胞蛋白含量進行測定。雙鏈寡核酸NF-κB序列探針(正義鏈：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′,反義鏈：5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACCTGA-3′)，6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠100V預電泳60min，待溴酚藍泳動為3/4全長時停止電泳，再將帶正電的尼龍膜和膠同時夾入電泳轉移槽進行印跡轉移，反應條件為380mA轉移30min。將膜置于濾紙上吸干水分后轉移至紫外燈下交聯15min，在封閉液和平衡液中于室溫下分別反應20min，經化學發光和X線曝光后拍照，用Quantity One 4.6.2(BIO, RAD)軟件對圖形進行光密度掃描，灰度值越高表示NF-κB激活程度越高。

11.Western blot法檢測蛋白表達：膠質瘤細胞提取蛋白后經按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取總蛋白，每份樣品使用20μg蛋白質，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，在4℃下使用5%脫脂奶粉封閉過夜，硝酸纖維素膜經一抗和二抗反應后滴加新鮮配置的ECL化學發光液顯色、曝光和顯影。

結 果

1.miR-130b在膠質瘤細胞系和正常星形膠質細胞中的表達:應用實時熒光定量PCR檢測膠質瘤U251、SHG-44和U87細胞和正常星形膠質細胞系NHA中miR-130b的表達，NHA細胞中miR-130b的表達水平分別為U251、SHG-44和U87細胞的4.29、7.23和10.30倍，差異均有統計學意義(P=0.000)。在3種膠質瘤細胞株中，U251細胞中miR-130b的表達相對較高，而miR-130b在U87細胞中的表達相對較低，選擇U251和U87細胞作為后續實驗材料(圖1)。

圖1 miR-130b在不同細胞株中的表達與NHA比較，*P=0.000

2.轉染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑對膠質瘤細胞中miR-130b和VEGFA表達的影響:將miR-130b模擬物轉染至U87細胞，同時將miR-130b 抑制劑轉染至U251細胞48h后，利用實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-130b的表達，miR-130b模擬物組U87細胞中miR-130b的表達明顯高于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細胞中miR-130b的表達水平顯著低于抑制劑 NC組(P=0.000)。miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉染膠質瘤細胞48h后，收集膠質瘤細胞條件培養基，應用ELISA法檢測細胞CM中VEGFA的表達水平，miR-130b模擬物組U87細胞CM中VEGFA的表達明顯低于模擬物NC組(P=0.004)，而miR-130b抑制劑組U251細胞CM中VEGFA的表達水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000,圖2)。

3.過表達/干擾miR-130b后膠質瘤細胞CM對體外HUVECs侵襲和小管形成的影響：為評估干擾/過表達miR-130b后膠質瘤細胞對體外HUVECs運動能力的影響，筆者分別提取了轉染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其對照的細胞CM，HUVECs經CM作用24h后進行Transwell小室侵襲實驗。如圖3A所示，細胞侵襲實驗結果表明，HUVECs經miR-130b模擬物組細胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細胞數為14.8±2.8，顯著低于模擬物 NC組(34.5±5.9)，兩組比較差異有統計學意義(P=0.000)；而HUVECs經miR-130b抑制劑組細胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細胞數為52.8±6.5，明顯高于抑制劑NC組(30.1±4.3)，兩組比較，差異有統計學意義(P=0.004)。

圖2 miR-130b對膠質瘤細胞中VEGFA表達的影響A.miR-130b;B.VEGFA

利用小管形成實驗檢驗過表達/干擾miR-130b的膠質瘤細胞CM對體外HUVECs的血管生成能力，HUVECs在體外Matrigel基質環境中生長12h后，細胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細胞延長端開始在Matrigel膠中伸展，相鄰細胞開始出現聯接并出現管腔樣結構。miR-130b模擬物組細胞CM處理的HUVECs體外小管形成數為24.9±2.7，顯著低于模擬物NC組(36.7±4.5)，兩組比較差異有統計學意義(P=0.004)；miR-130b抑制劑組細胞CM處理的HUVECs體外小管形成數為57.8±8.3，明顯高于抑制劑NC組(31.4±4.5)，兩組比較差異有統計學意義(P=0.002,圖3)。

圖3 miR-130b對HUVECs遷移和小管形成能力的影響A.Transwell小室侵襲實驗；B.小管形成實驗

4.TNF-α是miR-130b的直接靶基因：為了研究miR-130b在膠質瘤細胞血管新生中的可能作用機制，通過檢索miRBase數據庫獲得has-miR-130b序列，并通過運用生物信息學工具RNAhybrid 2.1、TargetScan和PicTar對miR-130b靶基因進行預測發現，TNF-α與has-miR-130b存在潛在的結合位點(圖4A)。為此，筆者進一步應用熒光素酶報告檢測系統對體外U87細胞中miR-130b對TNF-α的調控作用進行驗證。

熒光素酶報告檢測系統結果(圖4B)顯示，與共轉染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后細胞熒光素酶活性比較，在U87細胞中共轉染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miR-130b抑制劑后的熒光素酶活性值明顯升高，差異有統計學意義(P=0.004)；而共轉染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miRNA-130b抑制劑后細胞熒光素酶活性值與共轉染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后的細胞熒光素酶活性值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。miRNA-130b模擬物和miRNA-130b抑制劑分別轉染U87和U251后，應用Western blot法檢測膠質瘤細胞中TNF-α蛋白的表達，miR-130b模擬物組U87細胞中TNF-α的表達明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b 抑制劑組U251細胞中TNF-α的表達水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000，圖4C)。以上結果表明，miRNA-130b可與TNF-α的3′-UTR結合，TNF-α是miR-130b的直接靶向基因。

圖4 miR-130b對膠質瘤細胞中TNF-α和VEGFA表達的影響A.生物信息學工具預測靶基因；B.熒光素酶報告檢測系統；C.蛋白質電泳圖

5.過表達/干擾miR-130b對膠質瘤細胞中NF-κB活性及VEGFA蛋白表達的影響：將miR-130b模擬物或模擬物NC轉染至U87細胞，同時將miR-130b抑制劑或抑制劑NC轉染至U251細胞48h后，利用EMSA檢測膠質瘤細胞中NF-κB活性，結果如圖5所示，miR-130b模擬物組U87細胞中NF-κB活性較模擬物NC組明顯減弱(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細胞中NF-κB活性顯著強于抑制劑NC組(P=0.000)。

miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉染膠質瘤細胞48h 后，應用Western blot法檢測膠質瘤細胞中VEGFA蛋白的表達水平， miR-130b模擬物組U87細胞中VEGFA的表達明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細胞CM中VEGFA的表達水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000)。

圖5 miR-130b對膠質瘤細胞中NF-κB活性的影響

討 論

目前國內外公認的高級別膠質瘤有效的治療方案是根治性手術治療配合術后放療、化療，但即便接受正規的內外科聯合治療，其中位生存期也不超過12個月，因此，膠質瘤的防治研究是目前神經外科學家和基礎科研工作者所面臨的重任。研究表明，miRNAs在多種惡性腫瘤中扮演著致癌基因或抑癌基因的角色，同時在腫瘤轉移和血管新生中發揮著重要作用。miR-130b在多種惡性腫瘤中表達減少，同時與腫瘤進展和預后不良相關，但miR-130b與膠質瘤相關性研究尚未見報道。本研究發現，miR-130b在膠質瘤細胞中的表達較正常星形膠質細胞表達下調，因此，需要進一步研究miR-130b在膠質瘤惡性生物學行為中的作用。

血管新生作為一種新生血管管腔形成的生理過程，這個過程受血管生成促進因子和血管生成抑制因子雙重調控。既往研究表明，作為血管生成促進因子中最重要的一種，VEGFA在促進多種惡性腫瘤血管生成過程中起著至關重要的作用[9, 10]。腫瘤細胞產生的VEGFA與腫瘤細胞的擴散和轉移密切相關[11]。此外，VEGF拮抗劑如貝伐珠單抗應用于臨床可改善膠質瘤患者的預后[12]。本研究表明，上調miR-130b的表達可抑制體外膠質瘤細胞CM中VEGFA的表達，而下調miR-130b的表達可促進體外膠質瘤細胞CM中VEGFA的表達。因此，筆者提出miR-130b可能對膠質瘤細胞的血管新生產生一定抑制作用，本研究印證了這一假設。本研究中，筆者首次發現上調miR-130b的表達對HUVECs的運動能力和血管生成具有抑制作用，而下調miR-130b的表達對膠質瘤細胞促進血管生成的啟動和維持過程中起到重要作用，從而表明miR-130b對膠質瘤血管新生是必不可少的。然而，關于miR-130b如何調控血管生成以及miR-130b和VEGFA在膠質瘤中的中間信號轉導機制尚不清楚。

TNF-α在大量良性疾病和惡性腫瘤的發生和發展過程中扮演著關鍵調節器的作用[13]。最新證據顯示，TNF-α參與調節正常和異常的血管生成；人體血管內皮細胞在TNF-α的作用下可促進血管細胞黏附分子、細胞內黏附分子和VEGFA的分泌[14]。腫瘤細胞活化的肌成纖維細胞所分泌的TNF-α可以通過誘導促血管生成因子的表達，從而促進癌細胞外滲和血管生成[15]。然而，迄今為止尚未有miR-130-b和TNF-α的生物學功能研究報道。在筆者的研究中，下調miR-130b的表達可促進TNF-α在膠質瘤細胞中的表達，而TNF-α在miR-130b高表達的U251細胞中的表達水平顯著降低。此外，熒光素酶報告實驗進一步證實，miR-130b直接靶向調控TNF-α。

研究表明，NF-κB在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用，并且黏附分子和VEGF的表達與激活的NF-κB直接相關[16, 17]。TNF-α作為NF-κB的主要活化因子之一，TNF-α激活NF-κB的作用機制已有詳盡的研究[18，19]。本研究表明，miR-130b在膠質瘤細胞中的異位表達可抑制NF-κB活性，而敲除miR-130b的表達可增強NF-κB活性。此外，筆者發現miR-130b的表達下調可增加NF-κB的下游基因，如VEGFA的表達。至此，筆者發現miR-130b與VEGFA之間的調控機制是通過TNF-α/NF-κB這一中間信號通道來實現，TNF-α/NF-κB信號通道可誘導下游促血管生成因子表達，進而促進膠質瘤細胞血管新生，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA信號通路可能在調控膠質瘤血管生成中發揮關鍵作用。

綜上所述，本研究強調了miR-130b和VEGFA之間的相互作用的重要性，miR-130b可直接靶向調控 TNF-α，從而進一步調控NF-κB信號通道而控制膠質瘤血管生成。從機制上看，下調miR-130b可促進TNF-α的高水平表達，并有助于NF-κB激活和其下游基因VEGFA的表達。這樣，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA通路可能是未來膠質瘤治療的具體作用靶點，從而在揭示膠質瘤的發病機制及治療上具有一定積極意義。